1、人粒細胞—巨噬細胞集落刺激因子(hGM-CSF)是第一個被克隆和利用重組DNA技術生產的造血刺激因子，是一個具有多項潛能的造血生長因子，具有十分重要的臨床應用價值，在國際生物技術制藥市場上占有重要的位置。目前市場上銷售的hGM-CSF多是由大腸桿菌作為宿主生產的，由于其過表達及含內毒素的缺點，人們曾嘗試在酵母、哺乳細胞、昆蟲細胞、植物細胞中表達hGM-CSF，但或多或少都有一些缺陷。而藍藻作為新興的制備基因工程藥物的宿主具有遺傳背景簡單

2、，便于外源基因轉化、蛋白酶活性低、培養(yǎng)基低廉、不含內毒素等優(yōu)點，是制備基因工程藥物的很有潛力的宿主。 本文在利用魚腥藻7120作為宿主成功表達hGM-CSF基因的基礎上，對克隆到的hGM-CSF進行修飾，在基因的5’端添加了可以在藍藻中高效表達的SD序列，并將SD序列與起始密碼子ATG之間的距離調整為相差6個堿基，然后將hGM-CSF基因插入到中間載體pRL-439強啟動子PpsbA的下游，得到中間表達載體pRL-GMs，進一步

3、插入到穿梭載體pDC-08的相應位點，構建成穿梭表達載體pDC-GMs。利用三親接合轉移法轉化魚腥藻7120，通過相應抗生素篩選并經繼代培養(yǎng)后得到含有目的基因的轉基因藻GMs藻株。并對轉基因藻的最適生長條件進行了優(yōu)化篩選。同時本文還針對前期所構建的穿梭表達載體系統(tǒng)存在穩(wěn)定性欠佳，質粒易丟失的特點，所以又克隆了魚腥藻7120中編碼谷氨酰胺合成酶(GS)的glnA基因，將其作為整合平臺，插入到pRL-721中的hGM-CSF基因和強啟動子P

4、psbA的上游，構建成了整合載體pRG-GM。為提高hGM-CSF基因在魚腥藻7120中的表達效率和提高外源基因在魚腥藻7120中的穩(wěn)定性提供了資料。 本論文的主要內容及結果如下：1.克隆hGM-CSF基因，在5’端添加SD序列，并調整SD序列與ATG間距離，然后將其插入強啟動子PpsbA的下游，克隆到穿梭載體pDC-08的相應位點，構建成穿梭表達載體pDC-GMs，然后利用三親接合轉移轉化魚腥藻7120，通過相應抗生素篩選并經

5、繼代培養(yǎng)后得到含有目的基因的轉基因藻GMs藻株；轉基因藻DNA水平檢測，表明hGM-CSF已經轉入GMs藻株中；WesternBlot分析表明，在轉基因藻中表達了具有免疫活性的hGM-CSF。 2.通過對轉基因藻的最適生長條件測定發(fā)現，轉基因藻株的最適生長溫度為30℃，最適pH值為9.5～10.5，在調整了環(huán)境因子的基本培養(yǎng)基中，GMs藻株與野生藻的細胞密度和葉綠素含量并無顯著差異，建議使用BG-Ⅱ(-N)培養(yǎng)基。 3.

6、光合放氧測定結果顯示，在添加10mmol/L的NaHCO3后，相對于野生藻，GMs藻株的凈光合速率提高了32.3﹪，而真實光合速率上調了30.2﹪，光補償點下降了7個光強單位，光飽和點上調了約51個光強單位。 4.在研究添加外源碳源對轉基因藻生長的影響后發(fā)現，轉基因藻與野生藻相比具有更強的利用無機碳源(NaHCO3)和有機碳源(葡萄糖)的能力，最適添加NaHCO3濃度為15mmol/L，最適添加葡萄糖濃度為1.5﹪。與添加NaH

7、CO3相比，葡萄糖對藻細胞的促進作用更加明顯。這有利于實現微藻的高密度培養(yǎng)，也有利于以后的產業(yè)化大規(guī)模培養(yǎng)。 5.克隆了魚腥藻7120中編碼谷氨酰胺合成酶(GS)的glnA基因作為整合平臺，將其插入到pRL-721中的hGM-CSF基因和強啟動子PpsbA的上游，構建成了整合載體pRG-GM。 以上結果說明，我們選取魚腥藻7120作為宿主系統(tǒng)，成功表達了具有免疫活性的外源hGM-CSF。并且外源基因的轉入沒有影響宿主的生