1、目的:糖尿病是一種由多種因素相互作用造成的以高血糖為主要特征的慢性代謝性疾病。隨著社會經(jīng)濟的發(fā)展和人口老齡化,其患病率逐年增高,其中,糖尿病確診病例中有90％為2型糖尿病,其慢性并發(fā)癥嚴重影響著人們的生活質(zhì)量。1857年Jordao首次報道了糖尿病聽力損傷,引起人們廣泛的關(guān)注,并進行了大量的研究。目前國內(nèi)外學者主要從血管病變、神經(jīng)病變、代謝異常、遺傳基因?qū)W等方面對糖尿病聽力損傷的發(fā)病機制進行研究,多數(shù)報道認為由毛細胞損傷最終導致聽力損害

2、,但導致毛細胞損傷的具體機制仍沒有明確。近年來的研究發(fā)現(xiàn)縫隙連接通道(Gap JunctionChannel,GJC)在耳蝸中為細胞間通信和物質(zhì)交流提供了橋梁作用,以保證內(nèi)淋巴液中的高K+濃度和內(nèi)淋巴液穩(wěn)態(tài),從而實現(xiàn)耳蝸的聲音信號傳導功能。耳蝸中構(gòu)成縫隙連接的連接蛋白(Connexin,Cx)主要為Cx26和Cx30,臨床上由兩者突變造成的聽力損失表現(xiàn)為進行性高頻下降,這與糖尿病聽力損傷的臨床表現(xiàn)相似;生理學上由兩者突變造成聽力損失的機

3、制可能為兩者構(gòu)成的縫隙連接通道功能出現(xiàn)異常,從而影響內(nèi)淋巴液中K+濃度和內(nèi)淋巴液穩(wěn)態(tài),進而使毛細胞變性,從而導致聽覺傳導異常。Cx26和Cx30在2型糖尿病大鼠耳蝸中表達情況如何以及與聽力變化是否有關(guān),目前國內(nèi)外還沒有相關(guān)研究。
　　 本實驗在建立2型糖尿病大鼠模型的基礎(chǔ)上,,通過測定糖尿病大鼠早期的聽力學改變,采用耳蝸切片HE染色、免疫熒光組織化學染色觀察在不同時間正常大鼠和2型糖尿病大鼠耳蝸中Cx26和Cx30的變化,從分子

4、生物學水平探討Cx26和Cx30在2型糖尿病早期聽力損傷發(fā)生、發(fā)展過程中的作用
　　 方法:選用健康、清潔級雄性Wistar大鼠60只,無噪音接觸史,耳廓反應(yīng)靈敏,體重180±20g。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后將其隨機分為對照組20只、實驗組40只。對照組喂食常規(guī)飼料、實驗組喂食高糖高脂飼料8周后兩組動物全部禁食不禁水12小時,對照組大鼠按30mg/Kg腹腔注射檸檬酸緩沖液,實驗組大鼠按30mg/Kg腹腔注射鏈脲佐菌素(Streptozo

5、tocin,STZ)。于第9周末取大鼠尾靜脈全血測空腹血糖(Fasting blood glueose,FBG)＞7.8mmol/L且伴有胰島素抵抗為2型糖尿病動物模型。期間記錄正常組、實驗組造模前的體重,以及成模后第4周、8周、12周、16周、20周的體重、空腹血糖和尿糖;觀察各組大鼠活動、攝食、尿量、尿味、全身毛發(fā),耳廓反應(yīng)的變化。兩組大鼠在造模前及造模成功后第4周、8周、12周、16周、20周分別接受聽覺腦干反應(yīng)(auditory

6、 brainstem response,ABR)測試。對照組和實驗組大鼠在成模后第4周、8周、12周、16周、20周分別分批在全麻下進行全身灌注、斷頭、取出耳蝸、固定、脫鈣,制作耳蝸石蠟切片進行HE染色和免疫熒光組織化學染色觀察耳蝸形態(tài)變化和Cx26、Cx30在耳蝸內(nèi)表達變化。計量資料結(jié)果以均數(shù)士標準差(-x±s)表示,兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗或秩和檢驗,以P＜0.05為存在顯著性差異作為判斷標準。
　　 結(jié)果:
　　

7、1一般觀察結(jié)果
　　 實驗組大鼠表現(xiàn)為多食、多飲、多尿、尿膻味明顯,隨病情發(fā)展,逐漸出現(xiàn)全身毛失去光澤、脫毛、明顯消瘦、活動減少、瘙癢等癥狀,耳廓反應(yīng)不靈敏。對照組大鼠外觀表現(xiàn)為正常,毛發(fā)光澤,無消瘦;耳廓反應(yīng)靈敏。
　　 2體重變化
　　 造模前和造模后4周實驗組和對照組大鼠體重無顯著性差異(P＞0.05.),造模后8周、12周、16周、20周實驗組大鼠體重明顯低于對照組大鼠,兩組比較有顯著性差異(P＜0.01

8、)。
　　 3空腹血糖、尿糖變化
　　 造模后4周、8周、12周、16周、20周實驗組大鼠空腹血糖始終＞7.8mmol/L,對照組大鼠空腹血糖始終＜7.8mmol/L,兩組比較有顯著性差異(P＜0.01);造模后實驗組大鼠尿糖始終為++++,對照組大鼠尿糖一直為±。
　　 4 ABR各項指標變化
　　 實驗期間,兩組動物ABRⅡ波閾值比較沒有統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。造模前實驗組大鼠和對照組大鼠比較Ⅰ波

9、、Ⅲ波、Ⅴ波的潛伏期和Ⅰ-Ⅲ、Ⅲ-Ⅴ、Ⅰ-Ⅴ波間期均沒有明顯差異(P＞0.05);造模后4周實驗組大鼠和對照組大鼠比較Ⅰ波、Ⅲ波、Ⅴ波的潛伏期和Ⅰ-Ⅲ、Ⅲ-Ⅴ、Ⅰ-Ⅴ波間期仍沒有明顯差異(P＞0.05);造模后8周、12周、16周、20周時實驗組大鼠和對照組大鼠比較Ⅲ波、Ⅴ波潛伏期和Ⅰ-Ⅲ、Ⅰ-Ⅴ波間期有統(tǒng)計學差異(P＜0.05),Ⅰ波潛伏期和Ⅲ-Ⅴ波間期沒有統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。
　　 5耳蝸石蠟切片HE染色
　　

10、 實驗組大鼠耳蝸組織血管紋中管腔樣結(jié)構(gòu)與對照組耳蝸組織血管紋比較減少:實驗組與對照組大鼠耳蝸螺旋韌帶中和螺旋神經(jīng)節(jié)細胞數(shù)量比較有統(tǒng)計學差異(P＜0.05),實驗組大鼠耳蝸螺旋韌帶中和螺旋神經(jīng)節(jié)細胞數(shù)量少于對照組。
　　 6耳蝸中Cx26、Cx30表達變化
　　 造模后4周實驗組和對照組耳蝸內(nèi)基底膜、血管紋和螺旋韌帶中Cx26、Cx30熒光表達強度無統(tǒng)計學差異(P＞0.05);造模后8周、12周、16周、20周實驗組和對

11、照組耳蝸內(nèi)基底膜、血管紋和螺旋韌帶中Cx26、Cx30熒光表達強度有統(tǒng)計學差異(P＜0.05),且實驗組耳蝸內(nèi)基底膜、血管紋和螺旋韌帶中Cx26、Cx30熒光表達強度弱于對照組。
　　 結(jié)論:
　　 1通過高糖高脂飲食結(jié)合小劑量鏈脲佐菌素腹腔注射可以成功制備2型糖尿病大鼠模型,并可作為研究2型糖尿病聽力損傷的動物模型。
　　 22型糖尿病大鼠早期即存在聽力損害,ABR可以作為其聽力下降早期診斷的客觀評價標準。