1、目的：以慢病毒為載體構建穩(wěn)定表達乙型肝炎病毒X基因(HBVX)的HL7702細胞株，探討HBVX穩(wěn)定表達對HL7702細胞線粒體結(jié)構和功能的影響。
　　方法：首先根據(jù)In-Fusion技術原理設計克隆引物，采用PCR技術從真核質(zhì)粒pcDNA3.1-X中擴增出含HBV X基因DNA全長片段，用In-Fusion交換酶將PCR產(chǎn)物與線性化慢病毒載體質(zhì)粒連接,經(jīng) PCR、測序、質(zhì)粒表達檢測鑒定。將構建成功的重組慢病毒質(zhì)粒 PLOV.CM

2、V.eGFP.2A.3×Flag＆HBx.EF1a.Pura與包裝質(zhì)粒psPAX2、包膜質(zhì)粒pMD2.G三質(zhì)粒瞬時共轉(zhuǎn)染293T細胞以包裝慢病毒顆粒，慢病毒顆粒的滴度采用熒光定量PCR的方法檢測。包裝好的重組慢病毒顆粒感染HL7702細胞，并經(jīng)過嘌呤霉素篩選獲得穩(wěn)定表達HBV X的細胞株HL7702/HBx，并經(jīng)過RT-PCR和Western-blot實驗證實HL7702/HBx細胞內(nèi)有HBV X穩(wěn)定持續(xù)的表達。以半定量RT-PCR方法

3、和Western-blot方法檢測細胞色素C氧化酶III(COXIII)表達水平變化，酶動力學方法檢測線粒體細胞色素C氧化酶活性，流式細胞術檢測細胞內(nèi)ROS水平和線粒體跨膜電位，利用激光掃描共聚焦顯微鏡采集熒光信號觀察COXIII與HBVX蛋白（HBx）在肝細胞HL7702內(nèi)的定位，掃描電鏡下觀察HL7702/HBx細胞線粒體超微結(jié)構的改變。
　　結(jié)果：成功構建表達3×Flag＆HBx融合基因的重組慢病毒表達載體，經(jīng)293T細胞包

4、裝和濃縮后，重組慢病毒滴度為8.61×107IU/ml。慢病毒感染 HL7702細胞后經(jīng)嘌呤霉素藥物篩選，得到穩(wěn)定表達 HBx的新細胞株 HL7702/HBx，經(jīng)RT-PCR和Western-blot分析結(jié)果顯示HL7702/HBx細胞能夠持續(xù)穩(wěn)定表達HBx。HBx在細胞漿和細胞核中表達，而細胞漿中HBx可分布于線粒體，并與COXIII共定位表達。掃描電鏡下發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定表達HBx的細胞線粒體較空白對照組和空載對照組線粒體脊稍腫脹，細胞形態(tài)及

5、結(jié)構無明顯改變。半定量RT-PCR實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)COXIII mRNA表達水平無明顯改變，Western-blot實驗結(jié)果表明HL7702/HBx細胞內(nèi)COXIII蛋白表達上調(diào)，線粒體細胞色素C氧化酶活性水平升高，同時也發(fā)現(xiàn)細胞內(nèi)ROS水平上升，而線粒體跨膜電位沒有發(fā)生明顯改變。
　　結(jié)論：成功構建穩(wěn)定表達HBx的細胞株HL7702/HBx。細胞漿中HBx可定位于線粒體并與COXIII相互作用，通過轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)COXIII表達，從