1、中國番茄黃曲葉病毒(Tomatoyellow leaf curl China virus，TYLCCNV)是典型的單組份雙生病毒，其伴隨的衛(wèi)星DNA(TYLCCNB)是該病毒在寄主植物上引起癥狀所必需的。研究發(fā)現(xiàn)，TYLCCNB的互補鏈上所編碼βC1蛋白是一個癥狀決定因子和RNA沉默抑制子。
　　為深入了解TYLCCNV/TYLCCNB在寄主植物上的致病機理以及植物在抵抗病毒侵染過程中所產生的防御反應。本研究對TYLCCNBβC1

2、與普通煙寄主因子RING finger蛋白NtRFP1的互作展開了研究。酵母雙雜交和雙分子熒光互補試驗發(fā)現(xiàn)，TYLCCNBβC1能與NtRFP1發(fā)生互作。序列分析表明，普通煙NtRFP1基因全長為1455 bp，預測編碼一個485aa的蛋白。另外，利用DNAStar軟件對普通煙NtRFP1蛋白進行聚類分析發(fā)現(xiàn)，其與辣椒CaRFP1和番茄SlRFP1等都具有很高的同源性，分別達到86.4％和83.4％。進一步通過InterProScan軟

3、件（http://www.ebi.ac.uk/Tools/InterProScan/）對NtRFP1蛋白的保守功能域進行了分析，結果表明NtRFP1蛋白主要含有VWA(von Willebrand factor(vWF) type Adomain)和RING(RING finger domain)兩個保守的功能結構域。根據(jù)NtRFP1的二級結構與保守功能域分別設計了4個NtRFP1突變體用于分析其與βC1蛋白互作的區(qū)域，結果表明NtRF

4、P1蛋白的RING結構域（第443-475位氨基酸）是與βC1蛋白互作的位點。
　　通過real-time RT-PCR測定NtRFP1 mRNA在普通煙中表達的組織特異性，結果表明NtRFP1 mRNA在種子中表達量最高，其次是在根和花中，而在葉子和莖中表達量最低。另外，TYLCCNV/TYLCCNB的侵染能上調NtRFP1 mRNA在普通煙葉片中的積累。通過亞細胞定位分析發(fā)現(xiàn)NtRFP1蛋白主要定位于煙草表皮細胞的細胞質與細胞

5、核中。
　　為深入研究NtRFP1與βC1體內互作的生物學意義，我們采用農桿菌介導的方法對普通煙進行遺傳轉化，獲得具有卡那霉素抗性的T0代普通煙植株，通過PCR篩選陽性轉基因植株，并利用real-time RT-PCR方法檢測轉基因植株中NtRFP mRNA在細胞內的積累水平，獲得過表達NtRFP1基因[NtRFP1(+)]或沉默NtRFP1基因[NtRFP1(-)]的轉基因普通煙植株。為研究NtRFP1蛋白對病毒誘導的癥狀以及植

6、物體內病毒DNA積累量的影響，對T1代具有卡那霉素抗性的NtRFP1(+)、NtRFP1(-)及野生型(WT)普通煙注射接種TYLCCNV/TYLCCNB并觀察癥狀。結果表明，與WT普通煙相比，NtRFP1(+)植株表現(xiàn)出輕微的癥狀，但病毒DNA積累量高;而NtRFP1(-)植株癥狀表型嚴重，但病毒DNA積累量低。表明NtRFP1蛋白能減輕病毒誘導的癥狀并負調控植物對病毒的積累。
　　利用PVX載體(pGR106)構建了GFP、N

7、tRFP1以及NtRFP1 E3 ligase-dead突變體NtRFP1 H459Y的重組表達載體，并分別與pGR106-βC1浸潤共接種本氏煙。共表達βC1與NtRFP1蛋白的植株表現(xiàn)出輕微的癥狀，而共表達βC1和GFP或NtRFP1 H459Y蛋白的植株癥狀表型嚴重。通過免疫印跡分析，共表達NtRFP1樣品中的βC1蛋白含量明顯比對照組共表達GFP樣品中βC1蛋白含量少，幾乎檢測不到βC1蛋白;而共表達NtRFP1 H459Y樣品