1、研究背景：
　　 螢光素酶(luciferase)是自然界中能夠催化底物產生生物熒光的酶的統(tǒng)稱,在哺乳動物體內無內源性表達,檢測不受細胞內其他物質影響,并且具有敏感性高,特異性好,反應迅速,操作簡單,檢測范圍廣等優(yōu)點,作為報告基因在醫(yī)學、生物學、環(huán)境科學等領域研究已得到廣泛應用,其中最有代表性的是螢火蟲螢光素酶(Firefly luciferase,Fluc)。
　　 早在1956年,Green和MeElroy就得到了螢

2、火蟲螢光素酶(Lueiferase)的結晶。螢火蟲螢光素酶是分子量為 60～64kD的多肽鏈在Mg2+、ATP、O2 存在時,催化D-螢光素(D-Luciferin)氧化脫羧,產生波峰在560nm左右的熒光。只有在活細胞內才會產生發(fā)光現(xiàn)象,并且光的強度與標記細胞的數(shù)目成正比。作為經典的螢光素酶,已經在細胞內 ATP 水平探測、感染檢測、藥物篩選、細胞標記和示蹤以及動物活體成像等方面都得到了廣泛的應用。目前應用最多的活體光學成像動物模型是

3、表達Fluc的動物模型。
　　 Gaussia luciferase(Gluc)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種新型螢光素酶,來源于海洋橈腳類動物(Gaussia princeps),其顯著特點是可以高效分泌至細胞外,同時具有更高的檢測靈敏度。Gluc與底物腔腸素的反應不依賴于 ATP,結合后發(fā)出的熒光波峰在480nm左右。由于Gluc具有分子量小、易分泌、檢測靈敏度高、半衰期短等優(yōu)點,已成功應用于體內外的實驗研究中。通過檢測分泌到模型動物血

4、液或其他體液中的Gluc活性,可以定量反映動物體內腫瘤的負荷,不僅能追蹤腫瘤轉移進展,而且能作為有效標記物體現(xiàn)腫瘤對治療的反應。并且螢光素酶與特定底物的發(fā)光反應屬于化學發(fā)光,具有特異性,不存在交叉干擾現(xiàn)象。
　　 基于上述特點,為了結合分泌性螢光色素酶Gluc和非分泌性螢光色素酶Fluc的優(yōu)點,本研究擬構建一種Gluc和Fluc雙螢光色素酶共表達的報告基因載體,并對其體內外表達特點進行研究,為下一步建立雙螢光素酶基因標記的腫瘤細

5、胞和動物模型、并對其進行體內外監(jiān)測和示蹤研究奠定基礎。
　　 研究目的：
　　 利用來源于 TaV的自剪切多肽 2A的編碼序列構建一種分泌型螢光素酶Gluc 和非分泌型螢光素酶 Fluc 共表達的雙報告基因載體,對其體內外表達及活體成像特點進行研究。
　　 研究方法
　　 1.重組表達質粒 pAAV2neoCAG-Gluc-2A-Fluc的構建
　　 采用重疊 PCR 技術獲得 Gluc-2A-F

6、luc 基因片段,引入酶切位點 Kpn Ⅰ和BglⅡ用于將融合片段 Gluc-2A-Fluc 定向克隆入表達質粒 pAAV2neoCAG 中,轉化大腸桿菌 DH5α,挑取氨芐青霉素抗性單菌落提取質粒,然后經酶切鑒定正確后送公司測序鑒定。
　　 2.細胞培養(yǎng)和瞬時轉染
　　 BHK-21 細胞在含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中,置于37℃,5％CO2的培養(yǎng)箱中進行貼壁培養(yǎng)。轉染前一天接種細胞,待 BHK-21 細胞匯合度

7、達到700％～80％時,采用脂質體轉染法將 pAAV2neoCAG-Gluc-2A-Fluc 轉染入 BHK-21細胞,轉染步驟按 lipofectamineTM 2000 說明書進行。將等摩爾混合的pAAV2neoCAG-Gluc 和pAAV2neoCAG-Fluc 質粒共轉染設為對照。Gluc 和Fluc在細胞水平的表達及分布特點研究在24孔板中進行。Gluc 和Fluc 在細胞水平的動態(tài)監(jiān)測研究在 96孔板中進行。
　　

8、3.收集細胞實驗樣品
　　 轉染一定時間后,收集細胞培養(yǎng)上清液和細胞裂解液。細胞裂解的具體步驟:將細胞用 PBS 清洗3遍,每孔加入200μl 細胞裂解緩沖液,冰上放置 30min后,將細胞懸液移入1.5 ml 離心管,12000rpm 離心 15s。收集上清液,并測量其體積。
　　 4.細胞實驗 Gluc 和Fluc 活性檢測
　　 按照試劑盒說明書檢測 Gluc 和Fluc 活性。分別取 20μl 細胞培養(yǎng)上

9、清液和細胞裂解液,加入 Gaussia luciferase Assay Kit的底物 50μl 或 Luciferase AssaySystem的底物 100μl,混勻后,用發(fā)光檢測儀(ModulusTM Luminometer)測定其相對光強度單位(Relative light unit,RLU),收集光子時間為 10 s,然后換算成細胞培養(yǎng)板中每孔細胞培養(yǎng)上清或細胞內總 RLU。
　　 5.小鼠體內 Gluc 表達監(jiān)測

10、r>　　 6 只6～8周齡、體重為 18～20g的雄性BALB/c 小鼠隨機分為2組,每組3只小鼠。在 5～7 sec內,采用水動力注射法,實驗組每只小鼠經尾靜脈注射 2.0ml含 10μg pAAV2neoCAG-Gluc-2A-Fluc 表達質粒的生理鹽水,對照組每只小鼠只注射 2.0ml 生理鹽水。注射后連續(xù) 7 d 分別經小鼠尾靜脈采取全血 2.5μl,加入Gaussia luciferase Assay Kit 中的底物,用

11、發(fā)光檢測儀(ModulusTM Luminometer)測定其相對光強度單位(Relative light unit,RLU)。
　　 6.小鼠活體成像
　　 質粒 DNA 注射雄性BALB/c 小鼠體內 12h 后,經腹腔注射麻醉劑戊巴比妥鈉(60～80mg/kg),麻醉后,經尾靜脈注射 300μL 含 50μg 腔腸素的PBS 溶液,立刻置于活體成像系統(tǒng)的暗箱中收集光子,每次收集光子 3min,連續(xù) 3 次。待小鼠體

12、內不再產生光子后(約30min),同一只小鼠腹腔注射 D-熒光素鉀鹽(150mg/kg),注射 1min、15min、30min 后,分別用活體成像系統(tǒng)收集光子 5 sec。
　　 研究結論
　　 1.我們成功構建了雙螢光素酶共表達載體 pAAV2neoCAG-Gluc-2A-Fluc。
　　 2.體外經細胞實驗驗證
　　 共表達質粒 pAAV2neoCAG-Gluc-2A-Fluc 能同時高效表達分泌型

13、的螢光素酶 Gluc 和非分泌型的螢光素酶 Fluc,且 Gluc 主要分布在細胞培養(yǎng)上清中,Fluc主要存在于細胞裂解液中,表明 TaV 2A 發(fā)揮了其高效的剪切功能,并未影響pAAV2neoCAG-Gluc-2A-Fluc 表達質粒中 Gluc 和Fluc的體外表達分布特點。
　　 3.體內經水動力轉染法及活體成像驗證
　　 TaV 2A介導的共表達載體pAAV2neoCAG-Gluc-2A-Fluc沒有改變Gluc

14、和Fluc在體內的表達及分布特點,實現(xiàn)了高效剪切的功能且剪切后產生的多肽沒有干擾Gluc在體內的分泌和活性。Fluc基因作為報告基因更適合于體內成像時的表達定位研究,而Gluc由于具有高效分泌入血的特性,用于成像定位研究時有可能造成錯誤的判斷；并且注射Gluc底物后其發(fā)光信號不穩(wěn)定且發(fā)光時間短暫,也不利于成像分析。
　　 總之,本研究設計和構建的pAAV2neoCAG-Gluc-2A-Fluc 共表達質?？梢酝瑫r高效表達分泌型螢

15、光素酶 Gluc 和非分泌型螢光素酶 Fluc,既可以利用螢光素酶 Gluc的分泌特性和高靈敏度,實現(xiàn)可以在不裂解細胞或處死動物的情況下通過檢測細胞培養(yǎng)上清液或血液中 Gluc的活性來動態(tài)監(jiān)測 Gluc的表達水平；同時又可以利用螢光素酶 Fluc的細胞內分布特點和發(fā)射光波長、穿透性好以及發(fā)光穩(wěn)定等特點,發(fā)揮其在動物活體成像方面的優(yōu)勢,比單一的螢光素酶報告基因載體在細胞標記和體內示蹤研究方面更具優(yōu)越性。本研究為細胞及動物模型的標記提供了一