1、第一部分 NG2蛋白多糖在腎小球中的表達及定位
　　目的:觀察大鼠乳鼠腎組織中NG2蛋白多糖的表達及其在腎小球的定位,對三種腎小球固有細胞系進行檢測,明確NG2在腎小球三種固有細胞中的具體表達情況。
　　方法:選擇出生1天的Wistar大鼠乳鼠,將其腎組織進行固定、包埋后制成石蠟切片,免疫組化檢測觀察NG2在大鼠乳鼠腎組織的分布,對腎小球中NG2的表達進行定位。以RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)條件永生化小鼠足細胞,DMEM培養(yǎng)基

2、培養(yǎng)大鼠系膜細胞,DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)小鼠內(nèi)皮細胞。間接免疫熒光染色共聚焦顯微鏡下觀察三種腎小球固有細胞中NG2蛋白的表達情況。以RT-PCR法檢測足細胞、系膜細胞和內(nèi)皮細胞中NG2 mRNA的表達。
　　結(jié)果:NG2蛋白在腎組織中有陽性表達,在腎小球中主要定位于系膜細胞及其周圍系膜區(qū)。在系膜細胞中NG2蛋白呈陽性表達,NG2均勻分布在系膜細胞胞膜上,而在細胞核上無表達;NG2蛋白在足細胞和內(nèi)皮細胞中均無陽性表達。RT-PC

3、R從mRNA水平證實了在三種腎小球固有細胞中,NG2僅在系膜細胞中表達。
　　結(jié)論:腎小球中NG2表達于間葉組織來源的腎小球系膜細胞,在系膜細胞及其周圍的系膜區(qū)均有表達,而在另外兩種腎小球固有細胞中無表達,提示腎小球中NG2由系膜細胞分泌,并向周圍系膜基質(zhì)中釋放。
　　第二部分 LPS刺激后大鼠腎小球中NG2蛋白多糖和炎癥因子的表達變化
　　目的:觀察脂多糖(LPS)刺激后大鼠乳鼠腎小球中NG2蛋白多糖的表達及促炎因子

4、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白細胞介素-1β(IL-1β)的表達變化,初步探討NG2與腎小球炎癥反應(yīng)之間的關(guān)系。
　　方法:選擇出生1天的Wistar大鼠乳鼠30只,分為3組:對照組、LPS組和LPS+Dex組,分別腹腔注射生理鹽水、LPS和LPS+Dexamethasone。12小時后,取其一側(cè)腎組織進行固定、包埋后制成石蠟切片,免疫組化檢測NG2在腎小球中的表達變化。另一側(cè)腎組織篩網(wǎng)法分離腎小球,提取腎小球mRNA和蛋白質(zhì)

5、,實時熒光定量PCR檢測NG2、TNF-α和IL-1β mRNA的表達,ELISA檢測腎小球中NG2、TNF-α和IL-1β蛋白的表達。
　　結(jié)果:NG2免疫組化結(jié)果顯示,NG2蛋白在腎小球系膜細胞及周圍基質(zhì)中表達,與對照組相比,LPS刺激后NG2蛋白表達明顯增多;LPS刺激并與Dexamethasone干預后NG2蛋白表達較 LPS組減少。分離的腎小球提取RNA,實時熒光定量PCR結(jié)果顯示,LPS刺激后腎小球中NG2、TNF-α

6、和IL-1β mRNA相對表達水平均高于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01);LPS刺激并與Dexamethasone干預后腎小球中NG2、TNF-α和IL-1β mRNA相對表達水平均較LPS組降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。分離的腎小球提取蛋白,ELISA結(jié)果顯示,與對照組相比,LPS刺激后RMC中NG2、TNF-α和IL-1β蛋白表達水平均升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01);LPS刺激并與Dexamethasone

7、干預后RMC中NG2、TNF-α和IL-1β蛋白表達水平較LPS組均降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。
　　結(jié)論:腎小球系膜細胞NG2高表達與腎小球炎癥密切相關(guān),NG2可誘導促炎因子TNF-α和IL-1β高表達,通過TNF-α和IL-1β介導腎小球炎癥反應(yīng)。
　　第三部分 NG2蛋白多糖在腎小球炎癥與系膜細胞增殖中的作用
　　目的:觀察LPS刺激后NG2蛋白多糖和促炎因子TNF-α和IL-1β在大鼠系膜細胞(RM

8、C)的表達變化,以及RMC的增殖情況;NG2-siRNA轉(zhuǎn)染RMC下調(diào)NG2表達后,觀察促炎因子TNF-α和IL-1β的表達變化及RMC增殖的變化,探討NG2與腎小球炎癥反應(yīng)及系膜細胞增殖之間的關(guān)系。
　　方法:(1)體外培養(yǎng)RMC,將細胞分為3組:對照組、LPS組和LPS+Dex組,干預8小時后,間接免疫熒光染色觀察NG2蛋白的表達,實時熒光定量PCR檢測RMC中NG2、TNF-α和IL-1β mRNA的表達,ElISA檢測RM

9、C培養(yǎng)上清液中NG2、TNF-α和IL-1β,MTT檢測RMC增殖情況。(2)設(shè)計及合成NG2-siRNA,用脂質(zhì)體法將其轉(zhuǎn)入體外培養(yǎng)的RMC,24小時后熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染標志Cy3的表達;48小時后PCR檢測NG2的干擾效率。(3)將細胞分為3組:正常對照組、LPS干預組和LPS干預+轉(zhuǎn)染NG2-siRNA組。NG2-siRNA轉(zhuǎn)染及LPS干預8小時后,實時熒光定量PCR檢測RMC中NG2、TNF-α和IL-1βmRNA的表達,El

10、ISA檢測RMC培養(yǎng)上清液中NG2、TNF-α和IL-1β,MTT檢測RMC增殖情況。
　　結(jié)果:(1)LPS刺激RMC8小時后免疫熒光結(jié)果顯示,與對照組相比 LPS組中NG2蛋白表達明顯增多,且分布均勻。LPS+Dex組NG2蛋白表達較LPS組減少,但仍多于對照組。(2)實時熒光定量PCR和ELISA結(jié)果顯示,LPS刺激8小時后RMC中NG2、TNF-α、IL-1β mRNA和RMC培養(yǎng)上清液中NG2、TNF-α、IL-1β蛋白

11、表達水平均升高,RMC增殖效率上升,與對照組相比,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。Dexamethasone干預可部分逆轉(zhuǎn)上述反應(yīng)。(3) NG2-siRNA轉(zhuǎn)染24小時后,Cy3呈強熒光表達;實時熒光定量PCR結(jié)果顯示,與未轉(zhuǎn)染對照組及陰性siRNA轉(zhuǎn)染組相比,NG2-siRNA轉(zhuǎn)染組NG2表達顯著下降,達到下調(diào)NG2表達的效果。(4)LPS刺激RMC8小時后,與對照組相比,RMC中NG2、TNF-α、IL-1β mRNA和RMC