1、原發(fā)性乳腺癌微小轉移灶的檢測及其意義,,概述,乳腺癌為婦女最常見的惡性腫瘤(31%)， 死亡率僅次于肺癌而位居第二(1996)。全世界每年死于乳腺癌約120萬。惡性腫瘤細胞轉移是主要致死因素。,轉移途徑：,血行轉移淋巴道轉移局部浸潤擴散臨床出現(xiàn)遠處轉移病人，80%有骨及骨髓(BM)轉移,目前臨床應用檢查方法難以查出微小轉移癌灶。 常規(guī)病理檢查（RPE）腋淋巴結陰性病例術后5年內遠處轉移發(fā)生率20%-30%。

2、準確檢測LN或BM微轉移有助于指導治療和判斷預后。,1.淋巴結微小轉移灶的檢測,1.1 微小轉移灶的定義,Huvos (1971): 2mm直徑,首先引入微轉移概念。Fisher (1978): 1.3 mmBlack (1980): <受累淋巴結的20%。,1.2 微小轉移灶的檢測方法及檢出率,連續(xù)組織病理切片檢查(Serial Sectioning)免疫組織化學染色（Immunohistochemistry,IHC)

3、分子生物學檢測,1.2.1連續(xù)組織病理切片檢查,連續(xù)切片檢查H&E染色比RPE增加微轉移檢出率7%-33%。根據切片間隔的不同，結果有很大差異。,Ludwig小組：將LN分成6個層次，每層取6張3?m切片，提高檢出率9%。Pickren: 間隔12?m連續(xù)切片，97例中發(fā)現(xiàn)24例（22%）。Fisher:間隔5?m，每4張取1張行H & E染色，78例中檢出19例（24%）Saphir & Amr

4、ommin:無間隔連續(xù)切片，每兩張檢測1張，30例中檢出10例（33%）。,缺點,工作量繁重， 臨床難以常規(guī)應用。,1.2.2 免疫組化染色,IHC應用不同MoAb檢測乳腺癌LN,10%-23%陽性,提高檢出率14%-17%。浸潤性小葉癌檢出率更高些。 連續(xù)切片再行IHC檢測，隱性癌灶檢出率會更高。McGuckin（1996）每100 ?m切取4張切片行IHC，208例查出53例（25%），其中67%轉移灶最大直徑

5、<0.5mm。,缺點,工作量大價格昂貴需要有經驗的病理醫(yī)師結合細胞形態(tài)才能確診,1.2.3 分子生物學檢測,RT-PCR技術檢測腫瘤細胞中特定標志物mRNA水平的表達,用于乳腺癌微轉移灶的檢測。 應用PCR方法最早報道于1988年對CML的監(jiān)測，對實體瘤始于1991年對PB中MM細胞的檢測。,RT-PCR檢測敏感性,Wang(1994):107淋巴細胞中檢測出3個MM細胞。Mattano(1992): 107正常

6、細胞中檢測出1個成纖維細胞瘤細胞。Noguchi(1994):106淋巴細胞中檢測出1個MCF-7細胞。Schoenfeld(1997):106正常BM細胞中檢測出1個乳腺癌細胞。,PCR比IHC方法敏感10-100倍，成為目前檢測乳腺癌LNM最敏感的方法之一。 在RPE-的LN中發(fā)現(xiàn)9%-38%的微轉移。,2.骨 髓微轉移灶的檢測,2.1 BM微轉移灶的定義,臨床現(xiàn)有檢查手段，包括X-r

7、ay，骨掃描，ALP和羥脯氨酸（hydroxyproline）檢測等均未能發(fā)現(xiàn)的轉移灶即為微轉移。此時處于骨基質尚未出現(xiàn)破壞的亞臨床階段。,2.2 BM微轉移灶的檢測方法及檢出率,常規(guī)細胞學檢查IHC檢查分子生物學檢測,2.2.1 常規(guī)細胞學檢查,無BM轉移臨床癥狀的病例,常規(guī)細胞學檢查陽性率甚低。雖然多點BM穿刺活檢是檢測BM轉移瘤的有效方法，但對微小轉移灶的檢測價值仍很有限，其最高陽性率為3.6%(Mattano,1992),2

8、.2.2IHC染色檢測*敏感性,Osborne(1989): 2×105 BM細胞檢出1個MCF-7細胞,檢出率達95%,而常規(guī)細胞學檢查全部陰性。Molino(1991):利用三種不同方法（形態(tài)學、IHC 和流式細胞）檢測BM中的MCF-7細胞，結果：,* IHC：檢測陽性濃度0.00025%(1:4×105)* 行態(tài)學分析:檢測陽性濃 度0.05% (1:2×103)* 流式細胞分析:檢測陽性濃

9、度0.2%(1:5×102)作者認為IHC染色,無論是敏感性還是特異性方面均優(yōu)于其它兩種方法。,*標本采集,骨穿多于手術當日麻醉后進行，可選胸骨、雙側髂前上棘或雙側髂后上棘等單或多部位穿刺。抽取5-10ml骨髓液，經Ficoll-Hypoque液離心分層，吸取L-c層洗滌后涂片，針對特異性抗原行IHC檢查。,*檢出率,IHC技術用于乳腺癌BM微轉移的檢出率為16-48%。Singhal(1994):對116例腫瘤切檢后病人

10、行BM穿刺，微轉移陽性率為32%；260例未曾切檢的病人陽性率為39%，二者無統(tǒng)計學差異。Diel(1992):證實手術前和手術后微轉移陽性率亦無顯著性差異。,*不足之處,IHC技術檢測乳腺癌BM微轉移，雖然診斷陽性率大大提高，但也有其局限性。某些正常BM細胞，如淋巴類上皮細胞等可能會出現(xiàn)不同程度的交叉反應，以及腫瘤細胞表面抗原表達的不均一性，均可能影響對轉移細胞的正確評判。,2.2.3 RT-PCR方法檢測,Schoenfeld(1

11、996):對IHC和RT-PCR兩種方法進行比較,IHC檢出1/105 MCF-7細胞,而RT-PCR為1/ 106。4例乳腺原位癌有1例（導管原位癌）IHC和RT-PCR均發(fā)現(xiàn)BM及血液中存在微轉移，經仔細檢查切除之病灶結果發(fā)現(xiàn)有微浸潤（Micro-invasion)存在。此例進一步證實乳腺癌具有早期播散特性。,Kruger等（1996）報道利用RT-PCR技術，骨髓微轉移的檢出率為41.7%。 Eaton等（1997） 報道，先用

12、免疫磁珠法分離癌細胞，再結合RT-PCR（Immunobead RT-PCR），檢測乳腺癌外周血中的瘤細胞，結果能由106白細胞中檢出1個瘤細胞，其敏感性與單用RT-PCR相仿。,* RT-PCR特異性：,聯(lián)合southern雜交技術能夠進一步提高微轉移的檢出率。但SCH（1994）報道利用巢式（nested）PCR進行兩步擴增，結果在正常淋巴結中亦出現(xiàn)CK-19表達，說明某些正常非上皮細胞亦可能有內源性CK-19 mRNA模板的極低水

13、平表達，故一味追求敏感性會導致特異性的降低，而以40輪PCR擴增聯(lián)合southern雜交為宜。,3.聯(lián)合檢測淋巴結和骨髓的微轉移,淋巴結和骨髓聯(lián)合檢測可更加全面地了解腫瘤的微轉移情況，為此，我院于1998年3月～11月，采用RT-PCR并Southern雜交方法，以CK-19為標志物，對54例可手術原發(fā)性乳腺癌病人的BM標本進行了微轉移的檢測,其中聯(lián)合檢測了35例病人的LN和BM。,,4.用于檢測轉移腫瘤細胞的生物學標志物,欲檢

14、測轉移腫瘤細胞，需利用能區(qū)別于轉移部位組織而腫瘤細胞特異表達的生物學標志物。如MM中酪胺酸酶（Tyrosinase）基因的表達，前列腺組織中PSA的表達等。遺憾的是截止目前尚未發(fā)現(xiàn)乳腺組織特異性標志物，盡管Maspin基因對乳腺組織較為“特異”，但其在乳腺外轉移部位僅有20%～35%的表達。,* CK-19：研究最多。實際上，細胞角蛋白并非乳腺癌特異表達蛋白，其為主要表達于上皮類細胞的一組蛋白質（CK-1?CK-20），以CK-19在正

15、常上皮細胞和上皮性癌細胞的表達最為特異。? Brown等（1995）在非上皮組織中分別檢測了CK-8、CK-18、CK-19的mRNA，結果顯示，在廣泛的不同種類非上皮組織中均有CK-8和CK-18的表達，而CK-19表達陰性。,幾乎所有正常上皮細胞、上皮性腫瘤均有CK-19表達,，而非上皮來源的細胞通常不表達。? Bartek等于1985年即用CK-19 MoAb檢測其在乳腺組織和腫瘤中的表達。以后有多篇報道采用IHC或RT-P

16、CR等不同手段對不同組織進行了CK-19的檢測。,? Kwaspen（1997）實驗證實CK-19單抗RCK108與其它角蛋白抗體相比具有高度敏感和分布廣泛的特性，可用于常規(guī)處理石蠟切片上皮性腫瘤的檢測。,? EGP-2：是上皮細胞的又一標志基因,幾乎所有上皮來源的腫瘤均表達EGP-2,而非上皮來源的腫瘤,如淋巴瘤、間皮瘤、神經母細胞瘤和MM等則無表達。已有數(shù)篇應用單抗MoC-31檢測SCLC骨髓、外周血及胸水中的癌細胞。De Graa

17、f（1997）等研究顯示四種乳癌細胞系均有EGP-2基因的高表達,故EGP-2基因亦有望用于乳腺癌微轉移灶的檢測,?多形表皮粘蛋白MUC1：是又一檢測乳腺癌微轉移的生物學標志物，其為一種高分子糖蛋白，主要存在于某些上皮性組織和器官中，如乳腺、胰腺、卵巢和結腸等，特別是在所有正常及癌變組織中均表達，而在間葉組織中不表達。但有報道檢測CK-19基因表達比MUC1敏感10倍。,? c-myc和PIP：c-myc 為一種與腫瘤發(fā)生有關的原癌基因

18、（proto-oncogene），與腫瘤分化及DFS、OS密切相關。PIP（催乳激素誘導蛋白），為一種與乳腺癌相關的蛋白質。? 其它：上皮膜抗原（EMA）、?－HCG、CEA 、EGFR 、BRCA1 、BRCA2等。,5.微小轉移灶檢出的臨床意義,5.1淋巴結,早期研究認為，微轉移對患者的生存無任何不利影響,這些小的腫瘤細胞巢無臨床意義,以至于普遍認為尋找這些微小轉移灶徒勞無益。隨著研究的不斷深入,原有的觀點難以立足。,Rose

19、n：T1病人,轉移灶直徑<2mm,經10年隨訪,DFS、OS均會縮短,而對T2期病人則影響不著。 Claton & Hopkins：也認為小的淋巴結轉移灶對病人的影響取決于原發(fā)腫瘤的大小。 De mascard：單個轉移細胞,對病人的復發(fā)和生存期均存明顯差異。,近十五年的大宗病例報道中(>100例)均顯示隱性轉移灶能夠影響DFS或OS 。其中Ludwig小組的報道為第一篇大宗前瞻性研究，發(fā)現(xiàn)有微轉移的病人五年FD

20、S下降16%，OS下降9%。迄今為止，Hainsworth等于1993年報道應用IHC方法檢測LN微小轉移灶的病例數(shù)最多，共檢測了343例RPE-者，結果陽性率占12%，其五年FDS下降28%。而另一組報道十年OS下降25%，轉移灶僅為0.2mm亦對生存期產生影響。,有生存差異的報道均為大宗病例(147～921),且隨訪期至少6年。Rosen等人研究發(fā)現(xiàn),淋巴結有微轉移的病人與淋巴結檢測陰性病人生存率的比較,隨訪6年雖無差異,但隨訪10

21、年,有轉移的病人其生存率明顯降低,而與具有明顯轉移灶病人的結果相一致,提示欲判定微小轉移灶對病人預后的影響至少需要觀察10年以上。,5.2 骨髓,Sharp等將乳腺癌病人骨髓中分離出來的癌細胞于體外培養(yǎng)，結果其可形成克隆，接種裸鼠亦可形成腫瘤。提示臨床檢測乳腺癌病人骨髓微轉移對預測復發(fā)、轉移可能具有重要意義。,Cote等檢測49例I、II期乳腺癌病人，骨髓微轉移檢出率為37%，其中I期為23%，II期為38%，ALN-者為27%，ALN

22、+者為41%。平均隨訪29個月，共有12人（24%）出現(xiàn)復發(fā)，BM轉移最多（6例），其次為肝臟（3例）。BM微轉移陽性者復發(fā)率為33%，而陰性者僅為3%。若與LN轉移情況相結合，均陽性者,兩年復發(fā)率為42%；均陰性者無復發(fā)，差別非常顯著。,Mansi等檢測350例可手術乳腺癌病人，BM微轉移陽性率25%，且與腫瘤大小、腫瘤周圍血管受侵及ALN轉移情況有明顯相關性，經6年隨訪，微轉移陽性者，復發(fā)率為48%，而陰性者為25%。再次證實BM微

23、轉移陽性的乳腺癌病人，遠處轉移率高，總生存期縮短。,Molino等報道，對109例I、II期乳險腺癌病人于手術前或手術后2?4周行BM穿刺檢測微轉移，結果陽性率31.1%，BM微轉移與腫瘤大小、ALN轉移、月經狀態(tài)、和ER情況等因素比較，未發(fā)現(xiàn)明顯相關性，且對病人無病生存期（DFS）和總生存期（OS）的影響亦無統(tǒng)計學意義。但作者亦認為這種結果可能與隨訪時間短（3年）有關。,Results of bone marrow biopsy i

24、n 128 women with operable breast cancer stage I-II(Landys, etal. Breast Cancer Res & Treat),骨髓及血液中少量腫瘤細胞的檢測，對近年來開展的高危乳腺癌自體骨髓移植（ABMT）或外周血干細胞移植（PBSCT）亦有實用價值，如果這些治療用細胞中混有腫瘤細胞，無疑將影響其治療效果。,*PCR陽性結果的意義,時間短，無定論。亦有人認為，LN作為

25、正常和腫瘤性上皮細胞的清理部位，陽性信號可能僅代表免疫系統(tǒng)清除和過濾循環(huán)中腫瘤細胞的一種功能反應。這樣可能導致PCR反應特異性的降低，如何區(qū)別這種淋巴結中非轉移PCR陽性信號有待進一步探索。,小 結,近十余年來，隨著檢測手段的進步，LN或BM微轉移的檢出率明顯提高。盡管各家報道不盡一致，但多數(shù)認為其與乳腺癌的預后、復發(fā)、轉移有明顯的相關性，可作為一種有效的預后指標，結合其它因素，確定出具有早期復發(fā)、轉移危險的高危人群

26、，在其發(fā)展為臨床轉移之前，給予積極輔助治療，從而渴望降低乳腺癌病人的復發(fā)、轉移率，提高生存率，延長生存期。,同時，又能使部分低危險（微轉移陰性）病人免于不必要的化療造成的痛苦。骨髓微轉移檢測，尚可作為判定輔助治療療效的指標，亦可作為術后病人隨訪過程中預測復發(fā)、轉移的依據。,誠然，并非骨髓微轉移的存在預示將來定會出現(xiàn)復發(fā)、轉移，尤其是檢測中發(fā)現(xiàn)的極少數(shù)腫瘤細胞（如IHC發(fā)現(xiàn)的單個腫瘤細胞），因為轉移形成仍受多種因素的影響，但至少表明其具有