1、中文 中文 4940 字出處： 出處：Acosta J, Carpio Y, Borroto I, et al. Myostatin gene silenced by RNAi show a zebrafish giant phenotype[J]. Journal of biotechnology, 2005, 119(4): 324-331.外文翻譯 外文翻譯RNAi 沉默肌肉生長抑制素基因致斑馬魚表型巨大化 沉默肌肉生長抑制素基因

2、致斑馬魚表型巨大化Jannel Acosta 1，Yamila Carpio 1，Ingrid Borroto，Osmany Gonz´alez，Mario Pablo Estrada水產(chǎn)養(yǎng)殖生物技術(shù)項目，動物生物技術(shù)部門，遺傳工程和生物技術(shù)中心，郵政信箱：6162，哈瓦那 10600，古巴2004 年 12 月 23 日收到；修訂后的形式 2005 年 4 月 15 日在收到摘要： 摘要：肌肉生長抑制素是轉(zhuǎn)化生長因子-β（T

3、GF-β）家族的成員之一，是骨骼肌生長和發(fā)育的一個負調(diào)節(jié)因子。最近，據(jù)報導，表達肌肉生長抑制素前體蛋白的轉(zhuǎn)基因斑馬魚骨骼肌的纖維增加。其它新的研究結(jié)果表明，除了抑制增殖及分化，肌肉生長抑制素在肌細胞生成中也扮演著一個重要角色。我們已經(jīng)研究了斑馬魚雙鏈 RNA(dsRNA)抑制肌肉生長抑制素功能的能力。通過顯微注射羅非魚對應于生物活性 C-端結(jié)構(gòu)域，從肌肉生長抑制素蛋白第 268 個胺基酸的密碼子到端密碼子的 dsRNA，使實驗魚體重增加

4、。在早期的發(fā)育階段注入 dsRNA，可使斑馬魚肌肉發(fā)生增生或肥大。此外，干擾基因的影響表現(xiàn)出很強的dsRNA 量的依賴性。關(guān)鍵詞： 關(guān)鍵詞：斑馬魚，肌肉生長抑制素，核糖核酸干擾，基因沉默，肥大，增生1．介紹 ．介紹肌肉生長抑制素(MSTN)是轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）的成員之一，它對一些哺乳動物物種的骨骼肌生長起著關(guān)鍵的負調(diào)節(jié)作用。攜帶 MSTN 自然突變基因的“雙肌”品種的牛比標準品種有更多的肌肉(Lee 和McPherron，1

5、997 年；Kambadur 等人，1997 年；Grobet 等人，1997 年，1998 年)。敲除MSTN 基因的小鼠骨骼肌肉急劇增加，并最終導致其增生和肥大(McPherron 等人，1997年)。2001 年，Lee 和 McPherron 的報告指出，轉(zhuǎn)基因小鼠表達 MSTN 的原結(jié)構(gòu)域，卵泡抑素或啟動素受體 IIB 型(ActRIIB)在肌肉細胞中顯負性，增強肌肉的生長，各方面都類似于被敲除 MSTN 基因的小鼠。此外，由

6、于 MSTN 的抑制，轉(zhuǎn)基因魚 MSTN 表達原結(jié)構(gòu)下放置 3-4 小時，制作 dsRNA。經(jīng)退火的 RNA（dsRNA）的溶液加入 RNaseA（0.5 克/毫升）在 37℃放置 15 分鐘，降解至單鏈 RNA。在瓊脂糖凝膠上對不同的物種進行了檢查。所有 1-2 細胞階段的胚胎注射 5 個 dsRNA 分子/胚胎（注射液 1 fg/(L)）和 5×106 個dsRNA 分子/胚胎（注射液 1 ng/(L)） 。陰性對照組

7、胚胎顯微注射載體相同的菌種（PBS 1×，137 mM 氯化鈉，2.7 mM 氯化鉀，4.3 mM 磷酸氫二鈉?7H2O，pH 值 7.3） 。2.2. RT-PCR通過使用 Tri-試劑（Sigma 公司） ，按照制造商的說明提取受精 24 小時后的胚胎(hpf)的總 RNA。cDNA 第一鏈通過使用逆轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)（Promega 公司）合成 20_l，從總 RNA 的5_g 逆轉(zhuǎn)錄（RT）反應。PCR 進行 20_l 以 1:

8、5 稀釋比率的逆轉(zhuǎn)錄反應。方法與 Amali 等的（2004 年）相同，使用引物進行 PCR 擴增，得到 496 bp 的斑馬魚 MSTN 和最大 476 bp的 cDNA（用于作為內(nèi)標物模板量的差異正?；?。PCR 程序為：預變性 94℃下 2 分鐘；MSTN 進行 35 個循環(huán)，最大的片斷進行 30 個循環(huán)；在 94℃下進行 30 秒，55℃下進行 30秒和 72℃下進行 1 分鐘；最后延伸時間為 72℃下 7 分鐘。將 PCR

9、產(chǎn)物進行 1％凝膠電泳。使用 1D 圖像分析軟件（柯達）進行定量分析，由頻帶的強度計算基因表達的相對值。研究確定基因表達周期數(shù)的驗證測試，在該測試中進行所描述的 PCR 反應，但在不同的周期數(shù)終止。構(gòu)建了在不同 PCR 循環(huán)中產(chǎn)生的穩(wěn)定的 PCR 產(chǎn)物量的檔案，并在擴增曲線的指數(shù)區(qū)域內(nèi)選擇所使用的周期數(shù)。這是為了可以確保用 PCR 產(chǎn)物的量反映原樣品中模板的量。2.3．成長性評價和肌肉組織學分析 ．成長性評價和肌肉組織學分析要確定所有顯

10、微注射 30 天，60 天和 75 天后魚的體重。對各組中的 20 條個體的魚，各取肌肉組織，制成常規(guī)的石蠟切片，用甲醛固定 10 小時后，通過蘇木精—曙紅染色法（簡稱 H-E 染色法） ，進行肌肉組織學分析。選擇腹鰭底部的第一棘的垂直部分的肌纖維進行定量分析。對染色部分進行了拍照，并使用 DIGIPAT 程序（3.3 版本，Eicisoft，古巴）將圖像進行分析。確定一個固定的放大倍數(shù)（20 倍） ，在顯微鏡下對一個給定的區(qū)域內(nèi)纖維的

11、總數(shù)進行計數(shù)。2.4．統(tǒng)計分析 ．統(tǒng)計分析誤差條指示平均值的標準誤差。 （**）表示 P <0.01， （*）表示 P <0.05，顯微注射組作為學生 t-檢驗的對照組。3．結(jié)果與討論 ．結(jié)果與討論最近羅非魚（奧利亞羅非魚）的 MSTN 基因（GenBank 登錄號 AF197193）被發(fā)現(xiàn)并克隆。與羅非魚的核酸序列和氨基酸序列是高度同源的斑馬魚，DNA 序列同源性約是羅非魚的 74％（Rodger 等人，2001 年） 。