1、微生物以群落形式廣泛存在，它與眾多研究領域密切相關。在醫(yī)學領域，人體共生菌群被稱為人的“第二基因組”(The other genome)，與健康密切相關;在環(huán)境領域，微生物以群落形式發(fā)揮功能，驅動生命基本元素(C/N/S等)發(fā)生生物地球化學循環(huán)，分解各種污染物;在生態(tài)學領域本身，存在更多與微生物群落結構以及其動態(tài)變化相關的內容;此外，與微生物群落相關的研究領域還包括工業(yè)與資源微生物、農業(yè)與土壤微生物等。
　　 欲解答與微生物群落

2、相關的科學問題，首先必須清晰準確地分析微生物群落結構，即樣品中存在的微生物種類，以及各種類的數(shù)量。但是，在傳統(tǒng)的微生物群落分析方法中，“通量”、“準確性”、以及“成本”三大因素的制約使得微生物群落的測定成為多學科瓶頸技術?！案咄俊笔侵福槍蝹€樣品，需獲得高通量的數(shù)據(jù);同時，采用該方法分析樣品的通量要夠高，即能夠同時分析較多數(shù)量的樣品。對微生物群落結構研究方法而言，“準確”一方面指微生物種屬（或稱分類單元）的表征信息要盡可能明確;另一

3、方面，對不同分類單元的定量要盡可能準確。但是，傳統(tǒng)技術如DGGE、基因芯片等手段均不能在較低的成本下，實現(xiàn)高通量和準確的需求。
　　 近年來，通過454測序技術測定16S rRNA短標簽序列成為微生物群落研究領域的突破。它利用焦磷酸測序法獲得高通量的數(shù)據(jù)及相關生物信息學工具的交互發(fā)展促成微生物群落結構研究方法學的突破。但是，454測定16S rRNA標簽技術因成本較高，阻礙其普及運用，同時測序錯誤及生物信息學計算工具也還存在一些

4、問題。
　　 與454技術相比，Illumina平臺能夠提供更多的序列數(shù)量，從而顯著提高樣品分析通量，降低分析成本，并且序列準確性更高。但是，Illumina的測序特征是序列長度較短，過去不能達到測定16S rRNA可變區(qū)的需求。同時，由于Illumina平臺所獲得的序列數(shù)量成數(shù)十倍增長，原有的生物信息學分析工具均不能運用，如何解決其中的運算瓶頸也是制約Illumina分析微生物群落的關鍵之處。
　　 本論文首先驗證了通

5、過條碼引物擴增16S rRNA可變區(qū)，對PCR產物整體進行Illumina雙末端測序，進而通過序列分揀、拼接、質控、比對等生物信息學分析，獲得目標樣品中的微生物群落代表序列的新方法。該方法稱為BarcodedIllumina Paired End Sequencing，簡稱BIPES。本研究中，我們首次通過IlluminaPE75以及PE101測序技術（隨著測序技術的進展），測通16S rRNA的V6可變區(qū)，并建立一系列質控算法，比較不

6、同分析流程的準確性。結果發(fā)現(xiàn)，Illumina單末端序列的準確度僅為約97.9％，其分布特征為從序列開始5'端的99.9％到末端3'端的85％。在雙末端序列的反向互補拼接過程中，質量下降的3'端序列得到校正，從而將測序準確度顯著增加到99.65％。進而通過去除40-70 bp位點有2個或以上的錯配堿基，和引物區(qū)有錯誤的序列之后，BIPES序列的準確性進一步提高到99.93％。其中錯誤堿基比454法降低了1個數(shù)量級。本論文發(fā)現(xiàn)，BIPES

7、序列能夠基本反映初始模板中各序列的相對量，但是長序列和高GC含量的序列會被低估，表明PCR對群落分析還具有較為顯著的影響。在16S rRNA V6序列的測序中，BIPES方法單個run測得的序列數(shù)是焦磷酸測序的20-50倍，通量高;而且每條BIPES序列的成本不到一條焦磷酸序列的1/40，成本低;同時，BIPES以獲得的16S rRNA V6可變區(qū)作為分類單元的特征，可進一步做系統(tǒng)分類和比較，準確性較好。作為一個高性價比方法，BIPES

8、可以被廣泛用于環(huán)境和人微生物組的微生物群落結構研究。
　　 在獲得大量的序列后，為了進一步分析序列所代表的群落結構，進而進行α和β多樣性比較，需進行大量的生物信息學分析。其中第一步需要將序列進行比對，進而將一定相似度的序列聚類成可操作分類單元(OTU)，該步驟是分析微生物多樣性生物信息學的關鍵步驟。本研究建立了一種新的兩階段聚類(Two-stage-clustering，TSC)方法，能夠降低運算資源的需求，并且具有很好的準確性

9、。TSC根據(jù)豐度將序列分成兩組之后分別聚類。由于微生物群落本身的分布特征以及高通量測序錯誤發(fā)生的特點，造成測序結果中高頻數(shù)序列少，而低頻數(shù)序列多。我們對高豐度組采用嚴謹?shù)姆謱泳垲愃惴?hierarchical)聚類，該算法準確性高，但其運算隨序列數(shù)量成幾何技術增長。而我們的TSC算法有效控制了分層聚類比對序列的數(shù)量。其后，我們對包含大部分稀有序列的低頻數(shù)組采用貪婪的啟發(fā)式法(greedy heuristic)聚類以提高效能。其中全部的比

10、對均基于準確性最高的全局比對算法(Needleman-Wunsch算法)，以獲得準確的OTU聚類。為進一步提高計算效能和準確度，TSC采用了兩步不同的預聚類。Clone43_97up數(shù)據(jù)分析結果顯示TSC能準確的聚類已知數(shù)據(jù)，得到43個OTU。通過分析一組序列數(shù)約為11萬的真實數(shù)據(jù)Costello day3，結果顯示TSC只需消耗370s和185M的內存即可完成聚類過程，除UCLUST外，其它方法所需的時間和內存分別是TSC的10倍以上

11、和5倍以上。本研究發(fā)現(xiàn)，將序列分成兩組之后再聚類不僅提高了計算效能，而且減少由“噪音”序列組成的不合理OTU，這種OTU的特點是低豐度序列可連接高豐度序列，即ARA(abundant-rare-abundant)，經深入分析發(fā)現(xiàn)，TSC三種算法聚類所得的OTU中不存在ARA，而ARA在其它方法中的比例分別是:SLP4.2％、UCLUST3.0％、Mothur CL2％、Mothur AL2.3％、Mothur SL45.5％、ESPRI

12、T-SL22％。稀疏曲線分析結果顯示TSC所得曲線比UCLUST和采用AL的算法更低更平緩。另外，經DCA和PCoA分析不同方法聚類Costello數(shù)據(jù)所得OTU對數(shù)據(jù)結構比較的影響，結果顯示TSC、UCLUST和ESPRIT-AL均能良好的把口腔、腸道樣品分開。同時，一組未發(fā)表的數(shù)據(jù)的分析結果顯示TSC能顯示地點和溫度是影響樣品群落的兩個因素，而UCLUST只能提示溫度是唯一的影響因素。這兩組數(shù)據(jù)的分析結果說明，一般情況下，TSC和U

13、CLUST得到相似的beta多樣性比較結果，但是有時候TSC方法得到的beta多樣性比較效果要比UCLUST要略微好一些。本研究認為在PCR擴增子的高通量測序的分析中，測序數(shù)據(jù)的分布特征是提高計算效能和準確度的一個非常有用的要素。
　　 最后，我們用本方法分析一組抗生素數(shù)據(jù)以展示BIPES分析的完整流程，在本組數(shù)據(jù)分析中，BIPES的質控作用可剔除7-22％的低質序列。α多樣性分析結果顯示day0樣品的微生物多樣性最豐度，而且d

14、ay3-7樣品多樣性高于day14-21。B多性分析結果顯示時間和抗生素濃度是影響微生物群落結構的主要因素。
　　 本論文建立了通過Illumina測序，分析微生物群落多樣性的分析流程。我們建立了BIPES技術，可以獲得高質量的V6序列，我們開發(fā)了TSC算法，可以運算百萬數(shù)量水平的序列，獲得準確的聚類結果。同時，該聚類序列數(shù)據(jù)可通過GAST, RDP等工具進一步進行系統(tǒng)分類，獲得樣品中的微生物種類，以及各種類的相對數(shù)量。根據(jù)聚類