1、幾丁質(zhì)酶(EC3.2.1.14)是一種能水解幾丁質(zhì)中由β-1,4糖苷鍵連接的N-乙酰氨基葡萄糖胺(GlcNAc)的水解酶。幾丁質(zhì)是昆蟲(chóng)外骨骼、甲殼類動(dòng)物的外殼以及真菌細(xì)胞壁的重要的結(jié)構(gòu)組成部分。幾丁質(zhì)酶在營(yíng)養(yǎng)、形態(tài)發(fā)生以及對(duì)病原菌侵染的抵御方面有著重要的生理學(xué)作用。斑馬魚(yú)是研究發(fā)育生物學(xué)的理想模式生物,而且其在免疫學(xué)、人類疾病以及癌癥研究方面也有突出的貢獻(xiàn)。目前在斑馬魚(yú)中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有6種能編碼幾丁質(zhì)酶/幾丁質(zhì)酶類似蛋白的基因,而且其在胚胎

2、發(fā)育的10個(gè)不同階段的表達(dá)模式也已經(jīng)有相關(guān)報(bào)道。然而,有關(guān)幾丁質(zhì)酶在斑馬魚(yú)中所起到的生理功能還不清楚。因此,本文的研究目的是功能性的闡述斑馬魚(yú)幾丁質(zhì)酶基因,探索其在斑馬魚(yú)胚胎、幼體發(fā)育階段的功能。本文的研究將對(duì)斑馬魚(yú)胚胎如何保護(hù)自己不受病原菌侵染的作用機(jī)制的闡述打下基礎(chǔ)。
　　在本研究中,我們克隆了斑馬魚(yú)酸性幾丁質(zhì)酶-3的基因全長(zhǎng),并對(duì)其進(jìn)行了分析。從斑馬魚(yú)酸性幾丁質(zhì)酶-3的氨基酸序列以及結(jié)構(gòu)域來(lái)分析,它屬于典型的18家族幾丁質(zhì)酶

3、,包含有氨基端催化結(jié)構(gòu)域、PGST鉸鏈區(qū)以及羧基端的幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域。Chi3基因組結(jié)構(gòu)的分析表明,與人類以及其他脊椎動(dòng)物幾丁質(zhì)酶基因相類似,斑馬魚(yú)幾丁質(zhì)酶-3基因由12個(gè)外顯子和11個(gè)內(nèi)含子組成,這些研究表明在貫穿脊索動(dòng)物進(jìn)化的過(guò)程中,幾丁質(zhì)酶不論是在基因組組成上還是序列的同源性方面都是高度保守的。進(jìn)化樹(shù)分析表明,Chi3處于酸性幾丁質(zhì)酶分支,處于有頜類脊椎動(dòng)物的基部。
　　qRT-PCR顯示Chi3在斑馬魚(yú)肝和腸的表達(dá)量非常高

4、,這可能與斑馬魚(yú)的食性有關(guān)。斑馬魚(yú)是雜食性動(dòng)物,攝食多種底棲動(dòng)物和浮游甲殼類動(dòng)物、蠕蟲(chóng)以及昆蟲(chóng)幼蟲(chóng)。分解食物中的幾丁質(zhì)可能會(huì)造成酶的高表達(dá)量。從 qRT-PCR的結(jié)果還能看出,Chi3在胚胎中的表達(dá)量一直很低,直到受精后的第三天表達(dá)量才開(kāi)始顯著升高。
　　之前的一些研究表明,幾丁質(zhì)酶可能在非特異性免疫應(yīng)答中起到抵御微生物致病體的作用。而在本研究中,我們顯示了重組蛋白rChi3可以水解人造幾丁質(zhì)底物4-methylumbellife

5、ryl-β-D-N,N′,N″-triacetylchitotrioside,可以結(jié)合真菌白色念珠菌,也能對(duì)白色念珠菌的生長(zhǎng)起到抑制作用。有趣的是,催化結(jié)構(gòu)域重組蛋白Chi3-CD的酶活性、抑制真菌能力和結(jié)合真菌活性等都小于完整的Chi3蛋白,這證明幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域在斑馬魚(yú)幾丁質(zhì)酶3的免疫活性方面起著重要的作用。此外,我們還清楚闡釋了斑馬魚(yú)胚胎中的Chi3也有抗菌活性。首先,斑馬魚(yú)卵提取液與抗-rChi3抗體孵育之后,其抗菌活性明顯減弱