1、目的:采用HULTH造模方法構建新西蘭大白兔骨關節(jié)炎動物模型，續(xù)斷總皂苷進行干預，進而觀察軟骨組織形態(tài)、病理變化及炎癥因子表達，同時利用續(xù)斷總皂苷在體外干預軟骨細胞凋亡與增殖及其相關凋亡蛋白表達，從而了解續(xù)斷總皂苷在治療骨關節(jié)炎模型的作用機制。
　　方法:取28只新西蘭大白兔，分別每組設立7只，隨后隨機分為4組:分別是正常組、模型組、陽性對照組（美洛昔康）、治療組。利用構建新西蘭大白兔骨關節(jié)炎模型，然后在模型成功后1周對新西蘭大白

2、兔連續(xù)給藥6周，再對新西蘭大白兔骨關節(jié)炎的病理及相關炎性細胞因子進行檢測。(1)對各實驗組的軟骨組織進行收集，并且進行制作切片，然后觀察細胞形態(tài)學及軟骨組織病理的變化。(2)收集關節(jié)腔內關節(jié)液或者關節(jié)囊，然后采用ELISA法檢測關節(jié)液中TNF-α，IL-1β，PGE2和IL-6的含量。(3)利用Western blot技術檢測各組關節(jié)軟骨中MMP-3和MMP-1的蛋白表達含量。
　　(1)通過利用續(xù)斷總皂苷從而達到促進軟骨細胞生長

3、的實驗研究:利用新西蘭大白兔軟骨進行消化，從而獲得軟骨細胞，得到的軟骨細胞進行培養(yǎng)，利用第3代軟骨細胞進行實驗。然后利用顯微鏡觀察軟骨細胞的形態(tài)，利用免疫組化鑒定軟骨細胞及分化能力。實驗可以分為:高劑量組(續(xù)斷總皂苷終濃度為100ug/L)、中劑量組（續(xù)斷總皂苷終濃度為50ug/L）、低劑量組（續(xù)斷總皂苷終濃度為25ug/L）、對照組（續(xù)斷總皂苷終濃度為0ug/L）。在作用72h后，然后利用MTT檢測各組細胞的增殖能力，了解各組軟骨細胞

4、周期的分布。Western-blot檢測各組細胞中p21、CDK4、cyclinD1蛋白的表達。
　　(2)通過利用續(xù)斷總皂苷從而抑制軟骨細胞調亡的實驗研究:利用第3代軟骨細胞進行實驗。實驗分為:對照組、不加藥的模型組、低劑量、中劑量、高劑量，其中對照組加含10％胎牛血清的的DMEM培養(yǎng)基，其余各組均加入含有1mmol/L SNP的10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。Western-Blot檢測各組軟骨細胞凋亡因子Bcl-2、Bax、

5、NF-κB、Caspase-3、Caspase-9蛋白表達。Realtime PCR法檢測各組細胞中Caspase-3、Caspase-9MRNA表達。ELISA法檢測細胞上清液中IL-1β，IL-6，TNF-α和PGE2含量。
　　結果:1、通過體內實驗結果得知:正常組可以看到軟骨組織表面光滑，軟骨細胞分布均勻。而模型組軟骨組織則受到一定的破壞;治療組軟骨表面裂隙較少，軟骨組織損傷有所減輕。ElISA檢測關節(jié)滑液中TNF-α，I

6、L-6，PGE2和IL-1β的含量結果表明:與正常組相比，模型組關節(jié)滑液中TNF-α，IL-6，PGE2和IL-1β表達量明顯升高（P＜0.01）;與模型組相比，治療組關節(jié)滑液中TNF-α，IL-6，PGE2和IL-1β表達量明顯降低。Western-blot結果表明:與正常組相比，模型組中MMP-3、MMP-1蛋白含量顯著提高(P＜0.01);與模型組相比，治療組關節(jié)軟骨中MMP-3、MMP-1蛋白含量顯著降低(P＜0.01)。

7、>　　2、體外實驗結果:
　　細胞形態(tài)結構研究:
　　軟骨細胞鑒定:細胞染成藍紫色，細胞呈梭形，細胞核染成紫紅色的，根據(jù)流式鑒定結果該細胞符合間充質干細胞表型特征。軟骨細胞誘導分化:軟骨細胞在誘導14天后，細胞就會呈現(xiàn)出向成骨細胞分化的趨勢，就會發(fā)現(xiàn)呈梭狀生長，并且會出現(xiàn)重疊排列，通過茜素紅染色結果發(fā)現(xiàn)細胞會呈現(xiàn)出朱紅色，有鈣化灶結節(jié)出現(xiàn)。
　　利用續(xù)斷總皂苷從而會促進軟骨細胞增殖的研究:
　　結果表明，利用續(xù)斷

8、總皂苷后能夠顯著的促進骨關節(jié)炎軟骨細胞增殖，并呈劑量依賴性。
　　細胞周期分布及細胞周期蛋白表達:與對照組相比，中、高劑量組的G0/G1期明顯降低(P＜0.01)，G2/M期則則會出現(xiàn)明顯升高的情況(P＜0.05)。在通過干預72h后，與模型組相比，高、中劑量組的CDK4和CyclinD1蛋白的表達會顯著升高(P＜0.05);與對照組相比，中、高劑量組中p21的蛋白表達明顯降低(P＜0.05)。
　　續(xù)斷總皂苷抑制軟骨細胞凋

9、亡的研究:
　　與模型組相比，低、中、高劑量組中Bax蛋白表達明顯下降(P＜0.05);Bcl2蛋白表達明顯升高(P＜0.05)，且NF-κB表達同樣有該特點，中、高劑量表達低于模型組(P＜0.05)。與模型組相比，低、中、高劑量的Caspase-9、Caspase-3蛋白表達明顯下降;Realtime PCR結果表明，低、中、高劑量組中Caspase-3、Caspase-9mRNA表達量明顯低于模型組。與模型組比，低、中、高劑量

10、組的IL-1β，IL-6，PGE2和TNF-α表達量明顯降低(P＜0.05)。
　　結論:1、續(xù)斷總皂苷可以延緩OA模型中軟骨組織退變，與IL-1β，IL-6，TNF-α和PGE2分泌，降低MMP-1及MMP-3表達有關。
　　2、續(xù)斷總皂苷能夠促進軟骨細胞的增殖，且是通過增強細胞周期蛋白CyclinD1、CDK4表達，而抑制p21表達，并縮短細胞周期G0/G1期實現(xiàn)的。
　　3、續(xù)斷總皂苷能抑制SNP誘導的軟骨細胞凋