1、目的:
　　本課題旨通過體內(nèi)外實驗探討IFN-β修飾的人GMSCs對TSCC的生物學效應及作用機制，為臨床治療TSCC提供新思路。本實驗分離培養(yǎng)人GMSCs，構建表達IFN-β的慢病毒載體及空載載體，分別轉染人GMSCs得到GMSCs/IFN-β、GMSCs/vector，檢測GMSCs、GMSCs/vector、GMSCs/IFN-β及IFN-β在體外對TSCC細胞生物學活性的影響，并探討其作用機制;使用裸鼠TSCC移植瘤模型來

2、檢測GMSCs/IFN-β是否能夠選擇性的遷移至腫瘤組織內(nèi)，并作為IFN-β釋放的載體發(fā)揮抑制TSCC生長的效應。
　　材料與方法:
　　1.有限稀釋法克隆培養(yǎng)人GMSCs及其多向分化能力的檢測
　　牙齦標本取自進行牙冠延長術的健康牙齦組織，通過有限稀釋法分離培養(yǎng)人GMSCs，并檢測人GMSCs克隆形成能力、群體倍增值，流式細胞儀檢測其細胞表面干細胞標志物的表達。為檢測人GMSCs向成骨方向分化的能力，將GMSCs分別

3、接種于6孔板和24孔板中，加入成骨誘導液進行培養(yǎng)，基礎培養(yǎng)液為含10％胎牛血清(Fetal bovine serum，F(xiàn)BS)的細胞培養(yǎng)液(Dulbecco's Modified Eagle's Medium，DMEM)，誘導劑為50mg/L的維生素C、0.1μmol/L的地塞米松、10mmol/L的β-磷酸甘油鈉，培養(yǎng)28天(days，d)以后，在24孔板中進行茜素紅染液染色。
　　2.IFN-β修飾的人GMSCs構建
　

4、　構建帶有增強型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)標記的表達IFN-β的慢病毒載體(Ubi-MCS-3FLAG-SV40-EGFP-IRES-puromycin-IFN-β)及空載體病毒(Ubi-MCS-3FLAG-SV40-EGFP-IRES-puromycin)，分別轉染人GMSCs得到GMSCs/IFN-β及GMSCs/vector，為檢測攜帶IFN-β基因慢病毒的轉染效

5、率，轉染一周后，通過qRT-PCR檢測GMSCs/IFN-β及GMSCs/vector中IFN-β在mRNA水平的表達;并收集轉染一周后的條件培養(yǎng)基(Condition medium,CM)，通過酶聯(lián)免疫吸附實驗(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測CM中IFN-β蛋白的表達水平。
　　3.GMSCs、GMSCs/vector、GMSCs/IFN-β及IFN-β對TSCC細胞的體外生

6、物學效應
　　3.1.CM的收集
　　使用CM來檢測GMSCs、GMSCs/vector及GMSCs/IFN-β對TSCC細胞系Cal27細胞生物學活性的影響。GMSCs、GMSCs/vector及GMSCs/IFN-β以新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)24小時(hours，h)后，收集培養(yǎng)液作為CM，基礎培養(yǎng)基作為空白對照組（含10％FBS的DMEM），含750pg/ml IFN-β的基礎培養(yǎng)基作為陽性對照組。
　　3.2.CCK-8

7、(Cell counting kit-8)法檢測細胞增殖
　　TSCC細胞系Cal27細胞以1×103每孔的密度接入96孔板，接種細胞24h后按照設計的組別加入刺激，每天更換新鮮的刺激，于設計好的時間點每孔內(nèi)加入100μl含10μl CCK-8的DMEM，培養(yǎng)箱內(nèi)恒溫孵育2h后，使用酶標儀檢測450nm處OD值。
　　3.3.克隆形成實驗
　　Cal27細胞以1×103每孔的密度接入6孔板，接種細胞24h后按照設計的組

8、別加入刺激，每天更換新鮮的刺激，7d后采用結晶紫染色法染色，40倍鏡下計數(shù)形成克隆的數(shù)量，大于或等于50個細胞算一個克隆。
　　結果:
　　1.分離培養(yǎng)的人GMSCs的生物學活性
　　原代培養(yǎng)的人牙齦細胞呈成纖維細胞的形態(tài)特征，通過有限稀釋法分離培養(yǎng)人GMSCs，經(jīng)過14d培養(yǎng)后，通過克隆計數(shù)計算，人GMSCs的克隆形成率(colony forming unit-fibroblastic，CFU-F)為（21.4士2.

9、8）％;人GMSCs傳至12代時仍能表現(xiàn)出較高的生長活性，其群體倍增值為40.95士4.19;通過流式細胞儀檢測，人GMSCs表達間充質(zhì)源性干細胞表面標志物CD44、CD73、CD90、CD105、CD166和Stro-1，不表達造血源性干細胞表面標志物CD14、CD34、CD45;人GMSCs經(jīng)成骨誘導劑培養(yǎng)28d后，茜素紅鈣鹽染色顯示誘導組人GMSCs形成紅色的礦化結節(jié);人GMSCs經(jīng)成脂誘導劑培養(yǎng)28d后，油紅O染色顯示誘導組人G

10、MSCs細胞內(nèi)出現(xiàn)密集紅染的脂肪小滴;經(jīng)成軟骨誘導劑培養(yǎng)28d后，免疫組織化學染色顯示誘導組人GMSCs細胞團Ⅱ型膠原染色陽性;在qRT-PCR實驗中，經(jīng)過誘導的GMSCs組成骨相關基因（RUNX2、OPN和BSP2）、成脂相關基因(leptin、adipsin和PPARγ2)和成軟骨相關基因（aggrecan、COL-Ⅱ和SOX9）mRNA表達水平顯著高于未加誘導劑的正常對照組。
　　2.構建的GMSCs/IFN-β能夠穩(wěn)定表達

11、分泌IFN-β
　　攜帶IFN-β的慢病毒及空載體病毒轉染人GMSCs后，人GMSCs形態(tài)未發(fā)生明顯變化，細胞呈長梭形，有成纖維細胞的形態(tài)特征;轉染慢病毒48h后熒光顯微鏡下觀察，GMSCs/vector組與GMSCs/IFN-β組均有較強的熒光表達;QRT-PCR結果顯示GMSCs/IFN-β組IFN-βmRNA表達量顯著高于GMSCs、GMSCs/vector組（P＜0.01）;ELISA結果顯示GMSCs/IFN-β組IFN

12、-β分泌量為756.7±19.91pg/ml，顯著高于GMSCs、GMSCs/vector組（P＜0.01），表明GMSCs/IFN-β分泌的IFN-β蛋白水平與mRNA水平一致，而GMSCs與GMSCs/vector兩組間IFN-β的表達無明顯差異，實驗結果證實GMSC/IFN-β能夠穩(wěn)定的表達分泌IFN-β。
　　3.GMSCs、GMSCs/vector、GMSCs/IFN-β及IFN-β在體外顯著抑制Cal27細胞的生長增殖

13、
　　CCK8結果顯示，與空白對照組相比，培養(yǎng)2d后，各實驗組Cal27細胞生長增殖明顯減慢(P＜0.01）;而GMSCs/vector組與GMSCs組相比，Cal27細胞生長活性無顯著性差異;GMSCs/IFN-β組、IFN-β組，與GMSCs、GMSCs/vector組相比，表現(xiàn)出更顯著的抑制Cal27細胞生長的效應(P＜0.01）;GMSCs/IFN-β組與IFN-β組對Cal27細胞生長增殖的抑制效應無明顯差異?？寺⌒纬蓪?/p>

14、驗得到類似的結果，與空白對照組相比，各實驗組形成的克隆數(shù)目顯著減少(P＜0.01）;而與GMSCs組相比，GMSCs/vector組Cal27細胞克隆形成數(shù)目無顯著性差異;與GMSCs組、GMSCs/vector組相比，GMSCs/IFN-β及IFN-β表現(xiàn)出更顯著的抑制Cal27細胞克隆形成能力的效應(P＜0.01);GMSCs/IFN-β組與IFN-β組Cal27細胞克隆形成數(shù)目無明顯差異。為檢測GMSCs、GMSCs/vector

15、、GMSCs/IFN-β及IFN-β抑制Cal27細胞生長增殖的機制，使用流式細胞儀檢測各組對細胞周期及凋亡的影響，結果顯示，與空白對照組相比，各實驗組對Cal27細胞的細胞周期無顯著影響，各組Cal27細胞中S期細胞的所占的比例統(tǒng)計學差異;與空白對照組相比，各實驗組均顯著促進Cal27細胞凋亡（P＜0.01）;與GMSCs組、GMSCs/vector組相比，GMSCs/IFN-β及IFN-β表現(xiàn)出更顯著的促進Cal27細胞凋亡的效應(

16、P＜0.01)，結果證實GMSCs/IFN-β在體外顯著抑制Cal27細胞的生長增殖并促進其凋亡。Western blotting結果顯示，GMSCs/IFN-β作用后，Cal27細胞中AKT的磷酸化水平顯著下降，提示GMSCs/IFN-β抑制Cal27細胞的生長增殖，可能與AKT信號通路的下調(diào)有關。
　　結論:
　　1.通過有限稀釋法成功從人牙齦組織中分離培養(yǎng)出GMSCs。
　　2.成功構建IFN-β修飾的人GMSC

17、s(GMSCs/IFN-β)，GMSCs/IFN-β能穩(wěn)定表達分泌IFN-β。
　　3.人GMSCs能夠抑制TSCC細胞系Cal27細胞的生長增殖、遷移及侵襲，促進其凋亡，反映出GMSCs作為IFN-β釋放載體對TSCC治療的有效性和安全性。
　　4.與GMSCs相比，GMSCs/IFN-β能夠更顯著地抑制TSCC細胞生長增殖、促進凋亡、抑制其侵襲和遷移，Western blotting結果提示GMSCs/IFN-β抑制Ca

18、l27細胞的生長增殖效應，可能與AKT信號通路的下調(diào)有關。
　　5.尾靜脈注射的GMSCs、GMSCs/vector及GMSCs/IFN-β能夠向裸鼠TSCC移植瘤組織遷移并在體內(nèi)抑制腫瘤組織的生長，GMSCs/IFN-β(i.v.)顯示出比其他各組更為顯著的抑制腫瘤生長的效應，結果提示GMSCs/IFN-β在腫瘤組織局部分泌釋放IFN-β可能發(fā)揮抑制TSCC生長的效應，反映出GMSCs作為IFN-β釋放載體對TSCC治療安全有效