1、研究背景:
　　肺癌已經(jīng)發(fā)展成為了當(dāng)今全球最為常見的惡性腫瘤之一，它嚴(yán)重侵害了人類的身體健康，并且其發(fā)病率和死亡率在近些年來均表現(xiàn)出了上升的趨勢(shì)。肺癌按照組織病理類型劃分為了非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)和小細(xì)胞肺癌(SCLC)兩大類，其中非小細(xì)胞肺癌病理類型占所有確診肺癌的患者中的80％～85％，其余病理類型為小細(xì)胞肺癌。因?yàn)槌Ｒ姷脑缙诜伟┩ǔ]有典型的臨床癥狀，而且多數(shù)易感人群并沒有接受過定期的肺部體檢，所以僅僅只有16％的患者在

2、疾病的早期階段被診斷，而大多數(shù)的肺癌患者錯(cuò)失了早期診斷的最佳時(shí)期。肺癌臨床分期中的Ⅰ期和Ⅱ期非小細(xì)胞肺癌患者大多有機(jī)會(huì)接受手術(shù)治療。然而，多數(shù)肺癌患者被確診時(shí)，疾病往往已進(jìn)展為Ⅲ或Ⅳ期，這些晚期肺癌患者中的絕大多數(shù)已經(jīng)失去接受手術(shù)治療的機(jī)會(huì)。盡管采用手術(shù)方式切除腫瘤病灶仍然是目前治療肺癌的首選方式，但是為了增加手術(shù)切除的幾率和減少復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，一部分?jǐn)M接受手術(shù)的患者還需同時(shí)采用術(shù)前或術(shù)后輔助化療方案。而絕大多數(shù)臨床分期被劃為Ⅲ期和Ⅳ期的非小

3、細(xì)胞肺癌患者均需要接受化療。對(duì)于這些需要化療的肺癌患者來說，含鉑的聯(lián)合用藥方案是目前臨床公認(rèn)的治療中晚期非小細(xì)胞肺癌化療一線方案。鉑類藥物中應(yīng)用最廣泛的是順鉑，但是在臨床治療中普遍存在著原發(fā)性和獲得性的順鉑耐藥現(xiàn)象，這嚴(yán)重削弱了順鉑對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷效果。自從順鉑的耐藥現(xiàn)象出現(xiàn)以來，廣大研究者致力于探索順鉑耐藥性產(chǎn)生的原因，并且提出了一系列有關(guān)順鉑耐藥的分子生物學(xué)機(jī)制，研究發(fā)現(xiàn)順鉑耐藥相關(guān)機(jī)制是由多因素、多分子共同參的復(fù)雜過程，主要包括了

4、細(xì)胞凋亡通路的異常變化，DNA修復(fù)作用在細(xì)胞中的異常，藥物在細(xì)胞中蓄積減少，藥物去活作用增加，以及藥物作用相關(guān)信號(hào)通路的調(diào)控異常等。但是到現(xiàn)在為止，在腫瘤治療過程中出現(xiàn)的順鉑耐藥現(xiàn)象依然沒有得到解決，其具體的分子生物學(xué)機(jī)制尚未明確。因此，我們通過對(duì)肺癌順鉑耐藥相關(guān)機(jī)制進(jìn)行探索，進(jìn)而找到逆轉(zhuǎn)耐藥現(xiàn)象的方法，這對(duì)克服化療耐藥有著重要的臨床意義。
　　研究目的:
　　我們的研究通過非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)質(zhì)譜的方法在肺腺癌順鉑敏感細(xì)胞

5、與耐順鉑細(xì)胞中篩選出一系列的差異蛋白，并選取其中特異性的Id4蛋白進(jìn)行研究，明確其上游基因及下游信號(hào)通路。進(jìn)一步探索Id4基因在肺鱗癌及大細(xì)胞肺癌中與順鉑敏感性的關(guān)系，從而為攻克非小細(xì)胞肺癌治療中廣泛存在的順鉑耐藥現(xiàn)象提供新的分子生物學(xué)依據(jù)。
　　研究方法:
　　1.本研究通過非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)譜組學(xué)技術(shù)對(duì)人肺腺癌細(xì)胞株和其親本耐順鉑細(xì)胞株分別進(jìn)行檢測。篩選并分析兩親本細(xì)胞株中的差異蛋白及信號(hào)通路。并從中挑選出具有顯著差異的I

6、d4蛋白進(jìn)行深度探索。
　　2.對(duì)蛋白質(zhì)譜組學(xué)篩選出的Id4蛋白進(jìn)行驗(yàn)證。我們應(yīng)用Western blot技術(shù)驗(yàn)證Id4在兩個(gè)親本細(xì)胞株中蛋白水平的差異。應(yīng)用Real-time PCR檢測Id4在下游mRNA水平差異。
　　3.使用CCK8方法來測定腫瘤細(xì)胞對(duì)順鉑藥物的敏感性。流式細(xì)胞技術(shù)檢測兩親本腫瘤細(xì)胞在順鉑刺激下出現(xiàn)的凋亡率。
　　4.我們構(gòu)建了Id4質(zhì)粒，并將其轉(zhuǎn)染入順鉑敏感細(xì)胞中。分別檢測Id4表達(dá)升高后細(xì)胞

7、耐藥性、凋亡率和遷移能力的變化。以Id4基因序列作為模板，合成與能與Id4基因特異性結(jié)合的小干擾RNA。觀察干擾Id4基因表達(dá)對(duì)細(xì)胞耐藥性以及凋亡率的影響。
　　5.對(duì)蛋白質(zhì)譜篩選結(jié)果進(jìn)行深度分析。找出可能與Id4有關(guān)并參與順鉑耐藥的相關(guān)信號(hào)通路。對(duì)可能參與耐藥的信號(hào)通路進(jìn)行驗(yàn)證.。
　　6.探索Id4在肺鱗癌和肺大細(xì)胞癌順鉑敏感性中產(chǎn)生的影響。分別在肺鱗癌H520細(xì)胞和肺大細(xì)胞癌H460細(xì)胞中轉(zhuǎn)染Id4載體，觀察上調(diào)Id4

8、基因?qū)杉?xì)胞順鉑敏感性和凋亡率的改變。進(jìn)一步明確相關(guān)信號(hào)通路的改變。
　　研究結(jié)果:
　　1.通過Label-free非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對(duì)A549和A549/DDP細(xì)胞進(jìn)行差異蛋白的檢測，篩選出蛋白4140個(gè)，其中在A549中特有的蛋白886個(gè)，A549/DDP中特有的蛋白800個(gè)，A549和A549/DDP共有蛋白2586個(gè)，A549較A549/DDP表達(dá)上調(diào)蛋白718個(gè)，A549較A549/DDP表達(dá)下調(diào)蛋白281

9、個(gè)。其中Id4蛋白在A549/DDP細(xì)胞中較A549細(xì)胞上調(diào)6倍。
　　2.驗(yàn)證蛋白質(zhì)譜結(jié)果:A549/DDP細(xì)胞中Id4下游的mRNA量和蛋白表達(dá)水平明顯高于A549敏感細(xì)胞株(P＜0.05)。耐順鉑細(xì)胞株的半數(shù)抑制濃度為16.64±1.15μg/ml，顯著高與敏感細(xì)胞的1.67±1.23μg/ml(P＜0.01)。而耐順鉑細(xì)胞株的凋亡率為10.06±2.32％，明顯少于A549細(xì)胞的20.13±2.85％(P＜0.05)。驗(yàn)證

10、結(jié)果與質(zhì)譜組學(xué)篩選出的差異結(jié)果相吻合。
　　3.在A549細(xì)胞中上調(diào)Id4基因可以增加腫瘤細(xì)胞對(duì)順鉑耐藥性。在敏感細(xì)胞株中上調(diào)Id4基因后，發(fā)現(xiàn)Id4基因下游的mRNA水平以及蛋白表達(dá)量顯著升高(P＜0.05，P＜0.05)、腫瘤細(xì)胞半數(shù)抑制濃度由2.02±0.45μg/ml上升至7.11±1.59μg/ml(P＜0.05)、凋亡率下降從19.49±2.45％下降到13.09±2.19％(P＜0.05)。然而上調(diào)Id4基因的表達(dá)對(duì)

11、A549細(xì)胞的遷移及侵襲能力無影響(P＞0.05)。
　　4.A549/DDP細(xì)胞中的Id4基因被小干擾RNA沉默后可使腫瘤細(xì)胞對(duì)順鉑敏感性增加。在A549/DDP細(xì)胞中下調(diào)Id4基因后，Id4基因的下游的mRNA水平和蛋白表達(dá)量明顯降低(P＜0.01，P＜0.05)、細(xì)胞半數(shù)抑制濃度由16.73±2.37μg/ml下降至9.31±1.86μg/ml(P＜0.05)、細(xì)胞凋亡率明顯由10.21±2.35％升至15.61±2.44％

12、(P＜0.05)。
　　5.A549/DDP細(xì)胞中磷酸化P38MAPK蛋白的表達(dá)量明顯高于其親本A549細(xì)胞(P＜0.05)。轉(zhuǎn)染Id4質(zhì)粒使A549細(xì)胞中磷酸化P38MAPK蛋白表達(dá)明顯增高(P＜0.05)。當(dāng)用小干擾RNA沉默Id4基因后，A549/DDP細(xì)胞中磷酸化P38MAPK蛋白表達(dá)量也隨之下降(P＜0.05)。當(dāng)P38MAPK通路被SB202190(P38MAPK抑制劑)抑制阻斷后，A549/DDP細(xì)胞中磷酸化P38M

13、APK被抑制(P＜0.05)、IC50由16.64±1.15μg/ml下降到12.14±1.83μg/ml，(P＜0.05)、細(xì)胞凋亡率由(10.06±2.32)％升至（16.22±2.33）％，(P＜0.05)。上述結(jié)果提示Id4基因可以通過激活P38MAPK信號(hào)通路導(dǎo)致肺腺癌細(xì)胞產(chǎn)生順鉑耐藥性，抑制P38MAPK信號(hào)通路可以部分逆轉(zhuǎn)Id4基因?qū)е碌姆蜗侔╉樸K耐藥。
　　6.探索上調(diào)Id4對(duì)肺鱗癌H520和肺大細(xì)胞癌H460順鉑

14、敏感性的影響。轉(zhuǎn)染Id4質(zhì)粒使H460細(xì)胞的IC50由1.13±0.39μg/ml升至2.33±0.94μg/ml(P＜0.05)、凋亡率由14.21±2.07％下降到9.36±1.42％(P＜0.05)。但轉(zhuǎn)染Id4質(zhì)粒對(duì)H520細(xì)胞順鉑半數(shù)抑制濃度IC50和細(xì)胞凋亡率均無影響(P＞0.05)。結(jié)果提示上調(diào)Id4基因可以使肺大細(xì)胞癌H460細(xì)胞對(duì)順鉑敏感性降低并產(chǎn)生耐藥。但I(xiàn)d4基因?qū)Ψ西[癌H520細(xì)胞的順鉑敏感性無影響。
　　

15、7.研究上調(diào)Id4導(dǎo)致H460細(xì)胞對(duì)順鉑產(chǎn)生耐藥機(jī)制，發(fā)現(xiàn)上調(diào)Id4使H460細(xì)胞中磷酸化的Stat3和p38MAPK蛋白表達(dá)量均升高。在上調(diào)Id4基因的H460細(xì)胞轉(zhuǎn)染SB202190(P38MAPK抑制劑)后，IC50由2.33±0.64μg/ml下降到1.86±0.23μg/ml、凋亡率由9.36±1.42％升至10.65±3.89％(P＜0.05)。同樣，在上調(diào)Id4基因的H460細(xì)胞轉(zhuǎn)染W(wǎng)P1066（Stat3抑制劑）后，IC

16、50由2.11±0.37μg/ml下降到1.59±0.21μg/ml，(P＜0.05)、細(xì)胞凋亡率從9.82±1.24％升至12.15±4.17％(P＜0.05)。研究結(jié)果提示Id4可能同時(shí)激活p38MAPK與Stat3信號(hào)通路來抑制順鉑誘導(dǎo)的凋亡過程，從而導(dǎo)致大細(xì)胞肺癌對(duì)順鉑耐藥。抑制P38MAPK和Stat3信號(hào)通路可以部分逆轉(zhuǎn)Id4基因?qū)е碌拇蠹?xì)胞肺癌順鉑耐藥現(xiàn)象。
　　研究結(jié)論:
　　Id4造成肺腺癌順鉑耐藥的機(jī)制是