1、內(nèi)切木聚糖酶是木聚糖降解酶系的重要組成部分,可有效水解木聚糖的β-1,4糖苷鍵,在造紙、食品、能源、飼料及環(huán)境等領域中具有廣闊的應用。特別是來源于嗜熱微生物的嗜熱木聚糖酶,具有高溫催化活性、獨特的熱穩(wěn)定性等優(yōu)點,近年來引起國際學術界和工業(yè)界的廣泛關注。嗜熱微生物Dictyoglomus turgidumDSM6724分離自俄羅斯堪察加半島的烏宗火山,最適生長溫度達75oC,其基因組中含有一個潛在的GH11家族β-1,4內(nèi)切木聚糖酶基因,

2、其與Dictyoglomusthermophilum Rt46b.1的木聚糖酶XynB和Caldicellulosiruptor sp. Rt69 B.1內(nèi)切木聚糖酶序列一致性分別為81.8％和69%,與其它木聚糖酶的相似性均在60%以下。我們預測該基因編碼的木聚糖酶可能具良好的熱穩(wěn)定性,希望通過對其進行研究,發(fā)掘性質(zhì)優(yōu)良的新型木聚糖酶基因,并對其催化和熱穩(wěn)定性機制進行深入探討。
　　本研究成功地克隆了Dictyoglomus t

3、urgidum DSM6724中的β-1,4內(nèi)切木聚糖酶基因(Dtur_0243),并在大腸桿菌中進行了高效表達。經(jīng)過菌體破碎、熱處理和Ni-NTA親和層析,獲得了純化的重組蛋白DtX,其純化倍數(shù)為2.68倍,蛋白收率73.6%,純蛋白產(chǎn)量達830mg/L。酶學性質(zhì)表征顯示,DtX可高效水解多種木聚糖底物,對山毛櫸木聚糖底物的比活達825.4U。DtX具有良好的熱穩(wěn)定性和p H穩(wěn)定性,最適反應溫度為80oC,在85oC下的半衰期為300

4、min,在80oC保溫10小時活性基本完全保持;最適pH為6.5,在pH4-10之間能維持60%以上的活力。
　　對Dt X的氨基酸序列進行分析顯示,該酶含有兩個結構域,由催化結構域(Catalytic Domain, CD)和碳水化合物結合結構域(Carbohydrate Binding Module, CBM)組成,中間通過一段由14個氨基酸組成的連接肽(Linker)連接。為研究該酶結構域之間的相互作用和結構-功能關系,我們

5、構建了Dt X的兩種截短變體,分別是刪除了C末端CBM結構域的DtX-CDL,以及刪除了CBM結構域和Linker的Dt X-C D。兩種截短突變體均以胞內(nèi)可溶形式表達,且熱穩(wěn)定性及活性都比野生型發(fā)生了顯著變化。在最適條件下,DtX-CDL及DtX-CD的比活性分別比野生型提高了42.8%和17.92%,達到1441.8U和973.3U;90oC時DtX-CDL半衰期為1400分鐘,是野生型的55倍,而DtX-CD在同樣溫度的半衰期僅有

6、10分鐘,比野生型降低了60%,這顯示了CBM與Linker對酶性質(zhì)的關鍵調(diào)節(jié)作用。在此基礎上,我們通過對Dt X及其突變體進行了結構建模,發(fā)現(xiàn)Dt X-C D的催化結構域C末端最后一個β-片層與野生型相比明顯縮短。這使其缺失了穩(wěn)定酶二級結構的相關氫鍵網(wǎng)絡,可能是造成其穩(wěn)定性下降的主要原因。因此,在該區(qū)域引入額外的二硫鍵、鹽橋等穩(wěn)定作用,有可能進一步提高DtX的熱穩(wěn)定性。本論文克隆了Dictyoglomus turgidum DSM67