1、腦膠質瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最常見的原發(fā)性腫瘤之一，惡性水平高，具有很高的發(fā)病率與死亡率。近年來，雖然人們在腦膠質瘤的手術醫(yī)治以及術后放療、化療等方面取得了長足的進步，但是惡性腦膠質瘤病人的預后依然很差，確診后的平均生存周期不超過15個月。最新的研究發(fā)現(xiàn)，腦膠質瘤細胞中存在一小部分具備干細胞特征的細胞亞群，這類細胞可以持續(xù)增殖，具備自我更新能力和多向分化潛能，被定義為腦膠質瘤干細胞(Glioma stem cells，GSCs)。GSCs細

2、胞的存在是腦膠質瘤形成、浸潤、轉移、復發(fā)以及放化療耐受的主要原因。
　　MicroRNAs（miRNAs）是一類在進化上高度保守，長度大約在22nt左右的非編碼RNA分子，可以通過直接作用于下游mRNAs的3'端非翻譯區(qū)(3'Untranslated Regions，3'UTR)阻止mRNAs的轉錄，和/或誘導mRNAs的降解，進而在轉錄后水平調(diào)控機體內(nèi)基因的表達。越來越多的證據(jù)表明，miRNAs分子能夠起著類似于原癌基因或者抑癌

3、基因的作用，影響腫瘤細胞的形成與發(fā)展。此外，也有文獻報道指出miRNAs在腫瘤干細胞分化和自我更新的調(diào)控中也發(fā)揮著重要的功能。因此，可以通過改變miRNAs的表達量來降低腫瘤細胞和腫瘤干細胞的惡性程度，這可能是一個很有前景的治療方案。
　　在本研究中，作者通過高通量測序技術篩查發(fā)現(xiàn)，與腦膠質瘤細胞相比，GSCs細胞中miR-92a的表達水平顯著降低。之前的文獻報道表明，miR-92a在腦膠質瘤細胞系和腦膠質瘤病人的組織標本中高表達

4、，降低miR-92a的表達水平可以抑制腦膠質瘤細胞的增殖并促進細胞凋亡。然而，miR-92a在腦膠質瘤細胞遷移、侵襲以及GSCs細胞生存、遷移和自我更新中的功能尚不明確。所以，充分了解miR-92a在這兩種細胞中的功能和具體分子機制，可以為腦膠質瘤的治療提供新的思路。
　　研究目的：
　　探索miR-92a在腦膠質瘤以及GSCs細胞中的功能和詳細作用機制，為腦膠質瘤的靶向治療提供新的理論依據(jù)。
　　研究方法：
　

5、　1.采用無血清饑餓培養(yǎng)法從腦膠質瘤細胞（U87和U251）中分離培養(yǎng)出GSCs細胞，并用免疫熒光染色法鑒定GSCs細胞;
　　2.采用第二代高通量測序技術比較U87細胞和來源于U87的GSCs細胞U87s中miRNAs的表達量差異;
　　3.采用MTT、細胞劃痕、Transwell以及AnnexinⅤ-FITC/PI雙染法檢測miR-92a對U87和U251細胞體外增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響;
　　4.采用裸鼠成瘤

6、實驗檢測miR-92a在體內(nèi)對腦膠質瘤細胞生長的影響;
　　5.采用qPCR、Western Blot和腫瘤干細胞球成球等實驗檢測miR-92a對GSCs細胞生長、遷移以及自我更新的影響;
　　6.結合生物信息學方法和雙熒光素酶報告系統(tǒng)預測并鑒定miR-92a在腦膠質瘤細胞和GSCs細胞中的靶基因;
　　7.采用Western Blot和免疫熒光染色法確定miR-92a在腦膠質瘤細胞和GSCs細胞中作用的分子機制。

7、r>　　研究結果：
　　1.利用無血清饑餓培養(yǎng)法從腦膠質瘤細胞(U87和U251)中分離出GSCs細胞(U87s和U251s)，免疫熒光染色實驗結果表明，GSCs細胞表面表達腫瘤干細胞的分子標志CD133和神經(jīng)干細胞的分子標志Nestin，分化后的GSCs細胞表達神經(jīng)膠質細胞的分子標志GFAP以及神經(jīng)元細胞的分子標志β-tubulinⅢ;
　　2.高通量測序的分析結果顯示共有94個miRNAs在U87細胞和U87s細胞間差異

8、表達，其中miR-92a在U87s細胞中顯著低表達。qPCR鑒定結果表明miR-92a在U87s細胞和U251s細胞中均顯著下調(diào);
　　3.下調(diào)miR-92a的表達量在體外可以有效的降低U87細胞和U251細胞的增殖和轉移能力，同時促進細胞凋亡;
　　4.降低miR-92a的表達水平可以有效的抑制腦膠質瘤裸鼠模型體內(nèi)腫瘤的生長;
　　5.在GSCs細胞中上調(diào)miR-92a的表達量后，腫瘤干細胞球直徑變小、細胞遷移能力減

9、弱、腫瘤干細胞球形成率降低，細胞干性維持相關分子標志表達量下調(diào);
　　6.生物信息學預測和雙熒光素酶報告系統(tǒng)結果表明miR-92a在腦膠質瘤細胞和GSCs細胞中可作用于不同的靶基因，miR-92a在腦膠質瘤細胞中的靶基因為CDH1，在GSCs細胞中的靶基因則為Notch-1;
　　7.腦膠質瘤細胞內(nèi)miR-92a的表達量下調(diào)后，CDH1蛋白量增多，細胞核內(nèi)β-catenin含量減少，而總的β-catenin含量不變;

10、　　8.在GSCs細胞內(nèi)過表達miR-92a后，Notch-1蛋白下調(diào)，細胞內(nèi)磷酸化Akt的含量減少，而總的Akt含量不變;
　　9.過表達CDH1可以抑制腦膠質瘤細胞的轉移能力，而降低Notch-1的表達則可抑制GSCs細胞的生長、遷移和自我更新能力。
　　研究結論：
　　本研究首先從腦膠質瘤細胞中分離出GSCs細胞，通過高通量測序技術發(fā)現(xiàn)miR-92a在兩種類型的細胞中差異表達。qPCR結果證實，與腦膠質瘤細胞相比

11、，GSCs細胞內(nèi)miR-92a的含量明顯降低。降低miR-92a的表達水平可有效抑制腦膠質瘤細胞的增殖、遷移、侵襲，并促進細胞凋亡;miR-92a含量減少后，腦膠質瘤裸鼠模型體內(nèi)腫瘤生長速度也明顯減慢。另一方面，上調(diào)miR-92a的含量可以顯著抑制GSCs細胞的生長，遷移和自我更新。深入的機制研究表明，miR-92a可以通過分別作用于下游CDH1/β-catenin和Notch-1/Akt信號通路，影響腦膠質瘤細胞和GSCs細胞的惡性表