1、目的:
　　卵巢癌在婦科的惡性腫瘤中病死率極高，是女性生殖系統(tǒng)三大惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅著女性健康。雖然診斷方法仍在不斷的改進(jìn)，但是卵巢癌的易復(fù)發(fā)及伴隨出現(xiàn)的轉(zhuǎn)移和多重耐藥性，嚴(yán)重影響到卵巢癌的治療效果。由于在患病早期無特異性癥狀，缺乏有效的早期診斷措施，大部分患者確診時已多處于晚期，讓患者錯過了最佳的治療時機(jī)。為了能夠做到早診斷早治療，在早期有一些腫瘤抗原標(biāo)記物，例如經(jīng)典的CA125、CA199等，對于不同類型、不同部位的腫瘤大

2、多伴有不同程度的變化。特別是一些腫瘤標(biāo)記物隨著惡性程度的增加有相應(yīng)規(guī)律的變化，雖不具有普遍性，但已經(jīng)對卵巢癌的早期診斷、治療及手術(shù)預(yù)后療效的改善給予了極大的參考意見。
　　脂質(zhì)運載蛋白-2(lipocalin-2，LCN-2)，是分泌型糖蛋白，又命名為中性粒細(xì)胞明膠相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白(neutrophilgelatinase-associated lipocalin，NGAL)，屬于脂質(zhì)運載蛋白家族的第2號成員。研究發(fā)現(xiàn)，LCN-2

3、的上調(diào)與多種人類腫瘤相關(guān)，包括肝癌，乳腺癌，子宮內(nèi)膜癌和卵巢癌。然而，LCN-2在腫瘤細(xì)胞中的生物學(xué)作用還不是很清楚。本研究通過過表達(dá)LCN-2的方法來檢測其對卵巢癌細(xì)胞增殖的影響，探討LCN-2在卵巢癌中的表達(dá)和發(fā)展規(guī)律，為進(jìn)一步研究LCN-2在卵巢癌細(xì)胞中的作用機(jī)制提供信息平臺，以及為治療卵巢癌提供更多有價值的信息。
　　方法:
　　Western Blot分析檢測四種細(xì)胞系中(CAOV3，ES2，OVCAR3，SKOV

4、3) LCN-2蛋白水平上的表達(dá);瞬時轉(zhuǎn)染LCN-2質(zhì)粒后通過WesternBlot分析檢測過表達(dá)LCN-2在卵巢癌細(xì)胞ES2中的蛋白表達(dá);進(jìn)行G418篩選，探測未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的ES2細(xì)胞的生存臨界濃度;采用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染法觀察過表達(dá)LCN-2在卵巢癌細(xì)胞中的生長狀況，通過G418的篩選建立穩(wěn)定過表達(dá)LCN-2的ES2細(xì)胞系;MTT細(xì)胞增殖試驗檢測過表達(dá)LCN-2對卵巢癌細(xì)胞增殖的影響。
　　結(jié)果:
　　1 Western Blot檢

5、測四種卵巢癌細(xì)胞系（CAOV3，ES2，OVCAR3，S- KOV3)LCN-2表達(dá)情況，CAOV3和OVCAR3呈高表達(dá)，ES2未表達(dá)，SKOV3較低表達(dá)
　　Western Blot檢測這四種卵巢癌細(xì)胞系LCN-2表達(dá)情況，CAOV3和OVCAR3明顯表達(dá)，ES2未表達(dá)，SKOV3無明顯表達(dá)。常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)后，鏡下觀察四種細(xì)胞系的生長狀態(tài)，CAOV3和OVCAR3細(xì)胞形態(tài)大多為菱形和多邊形上皮樣細(xì)胞狀，ES2細(xì)胞形態(tài)呈橢圓形，S

6、KOV3呈梭狀上皮樣細(xì)胞形態(tài)。
　　2 構(gòu)建pcDNA3.1/mycHis-LCN-2質(zhì)粒DNA后，采用瞬時轉(zhuǎn)染法，驗證質(zhì)粒及LCN-2抗體的可用性
　　首先我們用實驗室已有的空載體pcDNA3.1/mycHis-LACZ和PEGFP-N3，分別構(gòu)建了pcDNA3.1/mycHis-LCN-2和PEGFPN3-LCN-2重組質(zhì)粒DNA。因LCN-2在ES2細(xì)胞中不表達(dá)，所以選擇ES2做瞬時轉(zhuǎn)染，pcDNA3.1/mycHis

7、-LCN-2，PEGFPN3-LCN-2作為實驗組;pcDNA3.1/mycHi-s-LACZ，PEGFPN3作為對照組，24小時后全部收獲，Western Blot分析檢測轉(zhuǎn)染LCN-2的實驗組均明顯過表達(dá)，充分可以說明LCN-2質(zhì)粒構(gòu)建成功，抗體結(jié)合良好。
　　3 G418藥物濃度檢測ES2產(chǎn)生耐藥的生長臨界濃度是700μg/ml。
　　G418藥物濃度梯度（200μg/ml，400μg/ml，600μg/ml，900μ

8、g/ml,1200μg/ml，1500μg/ml）置于六孔板中，觀察7天后發(fā)現(xiàn)ES2產(chǎn)生耐藥的生長臨界濃度為700μg/ml。
　　4 成功構(gòu)建LCN-2穩(wěn)定過表達(dá)的ES2細(xì)胞系
　　瞬時轉(zhuǎn)染的預(yù)實驗成功后，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染ES2細(xì)胞系，用700μg/ml G418進(jìn)行篩選，約兩周后克隆形成。選擇生長狀態(tài)良好的細(xì)胞團(tuán)進(jìn)行增殖，收獲后Western Blot分析檢測發(fā)現(xiàn)LCN-2在＃2，＃3，＃12，＃14，＃21，＃22，＃23和＃

9、31細(xì)胞株中的表達(dá)相對于V1，V2，V3和V7中明顯升高。Western Blot再次分析驗證了LCN-2在＃2，＃3，＃31和＃23中的穩(wěn)定過表達(dá)，并鏡下觀察發(fā)現(xiàn)ES2細(xì)胞株和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染LCN2后的ES2形態(tài)無明顯變化。
　　5 MTT細(xì)胞增殖試驗發(fā)現(xiàn)LCN-2有促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞增殖的作用
　　我們選取穩(wěn)定過表達(dá)LCN-2的＃2和＃3的兩個細(xì)胞株作為實驗組;空載體V1和V2的細(xì)胞株作為對照組，經(jīng)過6天的連續(xù)檢測，LCN-2過表

10、達(dá)組，相對于對照組，細(xì)胞的增殖速度明顯加快，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1 成功構(gòu)建了pcDNA/mycHis-LCN-2和PEGFPN3-LCN-2表達(dá)載體。
　　2 LCN-2在卵巢癌細(xì)胞系中的表達(dá)差異，對于研究LCN-2在卵巢癌中的作用具有重要的價值。
　　3 LCN-2的抗體與抗原結(jié)合良好，抗體效價較高。
　　4 構(gòu)建的LCN-2穩(wěn)定過表達(dá)的細(xì)胞系為以后進(jìn)一步研究LCN-2