1、研究背景：
　　I相藥物代謝酶細(xì)胞色素P450氧化酶（cytochrome P450 oxidase, CYP450）和II相藥物代謝酶尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶（UDP-glucuronide transferases， UGTs）主要存在于肝臟中，參與多種內(nèi)外源性化合物（包括藥物）的代謝， Cytochrome P450 oxidoreductase(POR)和cytochrome b5（b5）作為藥物代謝酶的供電子物質(zhì)在藥物

2、代謝中也具有重要的作用。CYP450和UGTs的多態(tài)性和含量差異是引起藥物藥效個(gè)體差異的重要因素，肝細(xì)胞癌（Hepatocellular carcinoma, HCC）是我國常見的腫瘤之一，臨床上，肝癌及其并發(fā)癥治療時(shí)藥物的劑量需要及時(shí)調(diào)整，然而，作為劑量調(diào)整的基礎(chǔ)，CYP及 UGT的含量在 HCC病人中是如何改變的，至今尚不完全清楚，因此，CYP450和UGTs含量的研究對(duì)肝癌病人臨床個(gè)體化治療方案的制定有重要意義。目前測(cè)定肝藥酶含量

3、的常用方法有免疫印跡法（Western blot）、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS）。其中，基于抗原抗體結(jié)合原理的Western blot法和ELISA法雖具有高靈敏度的特點(diǎn)，但特異性抗體制備困難，并且無法同時(shí)對(duì)同一樣本中的多種蛋白定量。而LC-MS/MS不需要制備特異性抗體，并具有高通量、高特異性以及線

4、性范圍寬等特點(diǎn)。本文建立了液相色譜-平行反應(yīng)監(jiān)測(cè)質(zhì)譜方法（liquid chromatography parallel reaction monitoring mass spectrometry, LC-PRM/MS），與選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)質(zhì)譜方法相比，LC-PRM/MS能夠獲得二級(jí)的所有碎片信息，并且結(jié)果能夠搜庫，保證定量的特異性。我們將建立的方法應(yīng)用于肝癌病人肝硬化組織中的藥物代謝酶含量的測(cè)定，期望為肝癌病人的臨床用藥提供參考。
　

5、　本論文共分為兩個(gè)部分。第一部分使用穩(wěn)定同位素標(biāo)記技術(shù)制備了定量肽段串聯(lián)體蛋白（Quantification concatemer，QconCAT）；第二部分建立了平行反應(yīng)監(jiān)測(cè)方法，并將該方法應(yīng)用于藥物代謝酶的定量中。
　　研究方法：
　　1.內(nèi)標(biāo)肽段的制備20種藥物代謝酶和POR以及b5各挑選2-3條特異性肽段，將選出的特異性肽段串聯(lián)成為了QconCAT蛋白，構(gòu)建可以表達(dá)該蛋白的基因序列，將其導(dǎo)入大腸桿菌后使用含重標(biāo)精氨酸

6、和賴氨酸的SILAC培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)成功的重組蛋白使用GST填料進(jìn)行純化，SDS-PAGE鑒定純度，并使用Trypsin進(jìn)行酶解。
　　2.內(nèi)標(biāo)肽段酶切效率和標(biāo)記效率的考察酶切后的肽段使用數(shù)據(jù)依賴采集模式考察酶切效率和標(biāo)記效率，使用ProteomeDiscoverer2.1搜庫檢索，對(duì)酶切肽段定性。
　　3.內(nèi)標(biāo)肽段的定量化學(xué)合成一條CYP1A2的標(biāo)準(zhǔn)肽段ASGNLIPQEK，使用氨基酸水解法進(jìn)行定量，將含量已知的標(biāo)

7、準(zhǔn)肽段梯度稀釋，加入等量的內(nèi)標(biāo)肽段，使用液相質(zhì)譜進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算內(nèi)標(biāo)肽段的含量。
　　4.人肝微粒體的定量及酶切使用差速離心法制備人肝微粒體（Human liver microsomes, HLMs），用Bradford法對(duì)人肝微粒體進(jìn)行定量，定量后取出10μg蛋白使用Trypsin酶切26小時(shí)。
　　5.液相-質(zhì)譜平行反應(yīng)監(jiān)測(cè)方法的建立將定量后的內(nèi)標(biāo)肽段與酶切后的人肝微粒體混合，使用數(shù)據(jù)依賴掃描模式，更換三根預(yù)柱，平行測(cè)定兩

8、次，結(jié)果使用ProteomeDiscoverer2.1搜庫鑒定，確定目標(biāo)肽段的保留時(shí)間和定量限，并篩選用于定量的子離子。
　　6.標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立將QconCAT蛋白梯度稀釋，加入等量酶切后的人肝微粒體，使用液相色譜-平行反應(yīng)監(jiān)測(cè)質(zhì)譜方法進(jìn)行掃描，建立定量肽段的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
　　7.液相-質(zhì)譜平行反應(yīng)監(jiān)測(cè)方法的應(yīng)用將建立的平行反應(yīng)監(jiān)測(cè)方法應(yīng)用于肝癌病人肝硬化組織中藥物代謝酶含量的測(cè)定。
　　研究結(jié)果：
　　1.重組蛋

9、白純度鑒定及定量 SDS-PAGE分析結(jié)果表示，表達(dá)的重組蛋白純度較高。使用 Bradford法對(duì)重組蛋白進(jìn)行定量，標(biāo)準(zhǔn)品的方程為y=9.8617x+0.1537，R2=0.9876，蛋白濃度為0.56 mg/mL。
　　2.重組蛋白的定性使用ProteomeDiscoverer2.1搜庫匹配目標(biāo)蛋白質(zhì)信息，所有內(nèi)標(biāo)肽段均為目標(biāo)蛋白的特異性肽段，匹配情況良好。
　　3.重組蛋白酶切效率及標(biāo)記效率的考察經(jīng)分析，純化蛋白僅存在一

10、個(gè)漏切位點(diǎn)，占所有肽段的10％以下，即酶切效率高，各個(gè)肽段標(biāo)記的均一性良好，標(biāo)記效率均達(dá)到90%。
　　4.重組蛋白的絕對(duì)定量使用子離子y5和y4的平均值作為QconCAT的定量結(jié)果，即134.75fmol；與兩組定量曲線使用母離子的定量結(jié)果相差不到1.1倍。
　　5.定量肽段保留時(shí)間和子離子的設(shè)置相同肽段使用不同色譜柱進(jìn)行色譜分離時(shí)，肽段的保留時(shí)間存在的偏差，而在同一色譜柱上對(duì)相同肽段的保留時(shí)間偏差小于1分鐘。使用搜庫結(jié)果

11、中信號(hào)強(qiáng)度最高的三個(gè)子離子用于肽段的定量。
　　6.標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立使用PRM方法建立藥物代謝酶定量肽段的標(biāo)準(zhǔn)曲線， R2值均在0.98以上，動(dòng)態(tài)范圍為5-200fmol。
　　7.肝癌病人肝硬化組織中藥物代謝酶的定量共測(cè)定12例樣本中6種藥物代謝酶的含量。CYP1A2、UGT1A1、UGT2B4、UGT2B15、POR以及 b5在樣本中的含量均值分別為67.36 fmol/μg、87.25 fmol/μg、92.97 fmo

12、l/μg、53.01 fmol/μg、140.65 fmol/μg以及84.91 fmol/μg。個(gè)體差異倍數(shù)分別為6.5、5.02、5.24、4.33、6.17和4.02倍；與正常組織相比，POR在肝癌病人的肝硬化組織呈高表達(dá)， UGT1A1與UGT2B15的含量與正常組織比有所降低，且差異顯著（p<0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.本研究構(gòu)建了串聯(lián)體蛋白，實(shí)現(xiàn)了規(guī)模化內(nèi)標(biāo)肽段的制備，并保證了內(nèi)標(biāo)的純度與標(biāo)記效率；

13、　　2.建立了藥物代謝酶的PRM分析方法，在此基礎(chǔ)上建立了絕對(duì)定量的標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性關(guān)系為0.99，動(dòng)態(tài)范圍為5-200fmol；
　　3.使用建立的方法測(cè)定了12例樣本中6種藥物代謝酶的含量，CYP1A2、UGT1A1、UGT2B4、UGT2B15、POR以及b5在樣本中的含量均值分別為67.36
　　fmol/μg、87.25 fmol/μg、92.97 fmol/μg、53.01 fmol/μg、140.65 fmol/