1、目的:
　　LPS（Lipopolysaccharide，脂多糖）是革蘭氏陰性桿菌外膜的主要成分之一，能夠直接促進腫瘤進展。TLR4能夠識別革蘭氏陰性桿菌的LPS，TLR4表達增強預示肺癌病人病情進展。這些發(fā)現(xiàn)表明通過LPS活化TLR4對肺癌進展至關重要。然而，肺癌進展是否與LPS直接相關及其相關機制尚不明確。
　　MiRs（MicroRNAs，寡核糖核酸）是非編碼小RNA分子，是重要的mRNA和蛋白表達的調節(jié)者，在癌癥進展

2、中充當了重要而又復雜的角色。MiRs與多種惡性腫瘤的發(fā)生進展密切相關。MiR-21是MiRs一種，是在實體瘤中最常見表達的寡核糖核酸，其在惡性腫瘤組織中表達量與正常組織相比高5～100倍。
　　在這些研究中，描述了LPS在肺癌腫瘤細胞生長過程中的作用，評估了MiR-21在其過程中的意義。證實在肺癌腫瘤細胞生長過程中MiR-21是必須的。肺癌腫瘤細胞中LPS活化TLR4后，會引起ROS產生增多，ROS反過來又會引起miR-21表達上

3、調。這些研究可進一步理解肺癌的發(fā)病機制，并對肺癌的治療提出新的治療措施。
　　方法:
　　道德規(guī)范聲明
　　所有病人通過郵件形式參與研究。臨床樣本研究遵從1964年《赫爾辛基宣言》及其修訂版。動物實驗按照醫(yī)學動物實驗手冊執(zhí)行。人和動物實驗也同時也遵從同濟機構(Institutiongal)倫理委員會。
　　病人
　　全部50名肺癌病人轉染革蘭氏陰性桿菌入組研究。肺癌均為病理診斷。樣本中有自身免疫疾病或經過免

4、疫治療的排除在外。
　　鼠
　　從上海動物實驗中心購買6-8周雌性BALB/c裸鼠，所有小鼠均在無病原體條件下飼養(yǎng)。
　　細胞培養(yǎng)和試劑
　　人肺癌細胞取自組織標本。將組織標本放置于50mL的離心管內，離心管內加入5～10mLⅠ型膠原酶溶液(Invitrogen)(在LHC培養(yǎng)基中溶解膠原酶Ⅰ，最終濃度為1mg/mL)。在37℃水浴箱中溫浴、振蕩1小時。將含青/鏈霉素、10％胎牛血清(fet bovine ser

5、um，F(xiàn)BS)的LHC培養(yǎng)基混勻細胞接種至24孔培養(yǎng)板中，放入35％CO、2℃、飽和濕度培養(yǎng)箱中，每2～3天觀察細胞生長狀態(tài)，并半量換液。LPS購自Sigma，psiRNA載體及對比劑購自Origene，Mir-21(MI0000077)表達載體及對比劑購自Origene，人miR-21shRNA(shADV-215486)及對比劑購自Vector Biolabs，Tempol購自Santa Cruz。所有試劑均規(guī)范使用。
　　體

6、外腫瘤生長
　　利用MTT比色法分析原代人肺癌細胞擴增表達觀察體外腫瘤生長。將96孔培養(yǎng)板每孔中接種4×103個肺癌細胞，加入或不加入LPS(0.1ug/ml、1ug/ml、10ug/ml)，培養(yǎng)3天，每天觀察腫瘤生長。用MTT比色法分析細胞擴增。
　　體內腫瘤生長
　　裸鼠內原代肺癌細胞生長監(jiān)測如前所述。將4×106個原代肺癌細胞懸浮于200ulPBS中，將其注射于裸鼠的皮下。相同劑量的PBS注入對照組小鼠。在皮下注

7、射前，用LPS(10ug/ml)處理原代肺癌細胞24小時，或用PBS作為參照。用數顯卡尺測量移植后3、6、9天后的腫瘤體積。每個腫瘤均被不同人員測量兩次。
　　R-T PCR檢測
　　利用QiagenRNeasy mini kit提取總的RNA，利用Maxima First Strand cDNA Synthesisb Kits（Thermo Scientific公司）轉錄合成cDNA，引物購自Applied Biosyst

8、ems公司，利用Maxima SYBR Green qPCR Master MIXES（美國Thermo）的試劑定量PCR分析進行重復檢測mRNA的表達，GAPDH作為內對照。TaqMan miRNA assays（Applied Biosystems公司）監(jiān)測miRNA表達，U6RNA作為內參照。
　　流式細胞儀檢測
　　流量分析，PE共軛抗體人抗TLR4抗體0.5×106個細胞染色(12-9917-42，eBioscie

9、nce公司)，或同型對照（12-4724-81，eBioscience公司），流式細胞儀分析。用CellROX Deep Red Reagent（Life Technologies公司）檢測ROS水平。FlowJo軟件分析統(tǒng)計數據。
　　結果:
　　1.LPS促進肺癌進展
　　為研究LPS在肺癌腫瘤細胞生長過程中的作用，用不同劑量的LPS(0.1ug/ml、1ug/ml、10ug/ml)刺激肺癌細胞，觀察細胞的生長。結

10、果顯示肺癌細胞的生長與LPS存在劑量依賴性。在肺癌細胞中能快速發(fā)現(xiàn)TLR4。TLR4被LPS刺激后，表達明顯上調，與劑量呈正相關。為研究TLR4、LPS在肺癌細胞生長中的作用，將肺癌原代細胞轉染上TLR4shRNA，然后給予LPS刺激調控。發(fā)現(xiàn)轉染上TLR4shRNA的肺癌細胞，TLR4在mRNA和蛋白水平上的表達均降低，并阻礙脂多糖誘導肺癌原代細胞的生長。這些數據表明TLR4是LPS誘導的腫瘤細胞生長的關鍵受體。
　　為確定在活

11、體上LPS促肺癌細胞生長過程中的作用，將肺癌細胞注入小鼠體內。發(fā)現(xiàn)有LPS刺激的肺癌細胞生長速度明顯高于無LPS刺激的肺癌細胞。阻斷TLR4后，就減緩了肺癌細胞生長。
　　實質上，這些結果表明通過LPS激發(fā)TLR4后可促進肺癌細胞生長。
　　2.LPS促進肺癌細胞生長中需要MiR-21
　　為評估MiR-21在LPS促進肺癌細胞生長中的作用，觀察MiR-21在肺癌細胞中的表達。發(fā)現(xiàn)MiR-21與LPS存在劑量依賴性。L

12、PS促進肺癌細胞生長過程中，阻斷TLR4后，MiR-21的表達同樣也出現(xiàn)抑制。當肺癌細胞轉染miR-21shRNA后，LPS激活肺癌細胞，發(fā)現(xiàn)轉染miR-21shRNA的肺癌細胞表達降低，并阻斷了LPS誘導的腫瘤生長。
　　為研究miR-21在LPS促進肺癌細胞體內生長過程中的潛在作用，將轉染miR-21shRNA和預處理LPS的肺癌細胞種植于裸鼠體內，結果顯示下調miR-21表達會減弱LPS增強肺癌細胞增長。這些結果表明LPS促

13、進肺癌細胞增長是需要miR-21強化的。
　　3.MiR-21促進肺癌細胞生長
　　假定MiR-21在LPS誘導腫瘤生長中的重要作用，發(fā)現(xiàn)了miR-21自身促肺癌細胞生長的功能。轉染miR-21的肺癌細胞導致miR-21表達上調和腫瘤生長。轉染miR-21shRNA緩解肺癌細胞生長。為證實在體內的研究結果，將轉染miR-21及miR-21shRNA的肺癌細胞分別植入裸鼠內，發(fā)現(xiàn)在體內增加miR-21表達增強腫瘤生長，降低mi

14、R-21表達會減弱腫瘤生長。這些發(fā)現(xiàn)認為miR-21是肺癌腫瘤生長的必須致癌miRNA。
　　眾所周知m iR-21作用于磷酸酶基因(PTEN)和程序性細胞死亡因子(PDCD4)，但是否在肺癌細胞中miR-21亦作用于PTEN和(PDCD4)。轉染miR-21的表達降低了PTEN和PDCD4的表達。反之亦然，轉染miR-21shRNA使PTEN和PDCD4的表達上調。更重要的是，PTEN和PDCD4的過度表達會阻斷肺癌細胞生長中m

15、iR-21的致癌作用。這些數據表明在肺癌中PTEN和PDCD4是miR-21主要作用目標。
　　4.LPS引起miR-21表達，引起細胞內ROS產生增加
　　活性氧(ROS)參與TLR4激發(fā)的免疫應答和肺癌進展。發(fā)現(xiàn)肺癌細胞內ROS水平與LPS濃度呈正相關，LPS濃度愈高，ROS水平亦愈高。結果表明在肺癌細胞中LPS促進ROS的產生。阻斷TLR4后則阻斷LPS誘導ROS的產生。為研究LPS誘導肺癌生長中ROS的作用，將LPS

16、處理的肺癌細胞，再用Tempol（4-羥基-2，2，6，6-四甲基哌啶）消除ROS。結果顯示，Tempol阻斷了LPS誘導肺癌生長。發(fā)現(xiàn)LPS誘導miR-21表達需要ROS，并發(fā)現(xiàn)Tempol阻斷miR-21與LPS正相關性。
　　為研究在體內LPS誘導肺癌細胞生長中ROS的作用，將含或無Tempol的LPS預處理的肺癌細胞注入裸鼠內，結果顯示在體內有Tempol的肺癌細胞抑制了LPS誘導的腫瘤生長。
　　總之，ROS產生增

17、加是LPS誘導miR-21表達和腫瘤生長是至關重要的。
　　5.在肺癌病人中TLR4表達與miR-21表達和ROS產生具有相關性
　　為證實在臨床上這些研究結果，分析了腫瘤組織和正常組織中TLR4和miR-21的表達。結果顯示TLR4和miR-21的表達在腫瘤組織中明顯增高。進一步分析，未接受治療的肺癌細胞TLR4、miR-21的表達和ROS水平。分析發(fā)現(xiàn)TLR4表達與miR-21表達和ROS水平存在相關性。在肺癌細胞中RO

18、S水平與miR-21表達具有正相關性。
　　這些結果表明在肺癌病人腫瘤進展中存在TLR4/ROS/miR-21通路。
　　結論:
　　在肺癌細胞中，LPS活化TLR4后導致ROS產生增加，又增加miR-21的表達和腫瘤增長。TLR4表達與miR-21表達和ROS水平存在緊密相關性，表明未治療的肺癌細胞存在TLR4/ROS/miR-21通路。這些結果揭示了個新的機制:革蘭氏陰性桿菌能加速肺癌進展，并為治療肺癌病人提供新的