1、本實(shí)驗(yàn)室先前采用馬尾松花粉粗多糖硫酸酯化多糖（SPPM60）作用與小鼠脾臟混懸細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SPPM60能顯著促進(jìn)脾臟混懸細(xì)胞內(nèi)自由鈣離子濃度的升高。由于脾臟淋巴細(xì)胞中富含T、B淋巴細(xì)胞，為了進(jìn)一步探究松花粉多糖及其酯化多糖對(duì)于脾臟淋巴細(xì)胞具體作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)室分別從脾臟中分離出了T、B淋巴細(xì)胞研究了松花粉多糖及其酯化多糖對(duì)其免疫調(diào)節(jié)作用，實(shí)驗(yàn)證實(shí)了馬尾松花粉酯化多糖對(duì)于T、B淋巴細(xì)胞都具有顯著的激活作用，均促進(jìn)了T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞

2、的增殖以及T淋巴細(xì)胞B淋巴細(xì)胞胞內(nèi)鈣離子濃度的升高。同時(shí)還通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了其中一條SPPM60作用于淋巴細(xì)胞引起胞內(nèi)鈣離子濃度升高的可能的胞內(nèi)鈣離子信號(hào)通路：SPPM60→Receptor→PI3K→PLC→IP3→IP3R→CRAC，其中Toll樣受體4是硫酸酯化多糖作用于B淋巴細(xì)胞的主要多糖受體。
　　一、采用熱水浸提提取松花粉粗多糖，進(jìn)一步用三氯乙酸法除去其中的蛋白質(zhì)成分以后再分別用20％、40%、60%、80%的乙醇對(duì)粗多糖

3、組分進(jìn)行依次沉淀。選取60%乙醇沉淀的多糖組分經(jīng)過聚丙烯酰胺凝膠柱層析對(duì)其進(jìn)行分離純化，直至最終得到一種較均一的組分，將其命名為PPM60-D。稱取14.87mg PPM60-D，采用氯磺酸-吡啶法對(duì)其進(jìn)行硫酸酯化，最終得到硫酸酯化多糖SPPM60-D18.57mg，氯化鋇-明膠比濁法測定硫酸酯化多糖的取代度為1.87。紅外光譜分析硫酸酯化多糖中有S=O和C-O-S的特征吸收峰，表明PPM60-D硫酸酯化成功。
　　二、采用腹腔灌

4、洗法提取小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，用MTT法檢測PPM60-D和SPPM60-D在不同作用濃度下對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞相對(duì)活性的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)800μg/mL的SPPM60-D能明顯增強(qiáng)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的相對(duì)活性，而PPM60-D對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的作用相對(duì)較弱。用MTT法檢測PPM60-D和SPPM60-D在不同濃度下對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7增殖能力的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)800μg/mL的SPPM60-D能顯著增強(qiáng)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7的增

5、殖能力，而PPM60-D對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7的促增殖作用效果相對(duì)較弱。
　　三、用雙波長熒光分光光度計(jì)檢測800μg/mL SPPM60-D處理的巨噬細(xì)胞RAW264.7后[Ca2+]i的變化情況。800μg/mL SPPM60-D顯著的提高了巨噬細(xì)胞RAW264.7胞內(nèi)自由鈣離子濃度。采用抑制劑處理鈣離子通路中的幾個(gè)關(guān)鍵蛋白后發(fā)現(xiàn)2-APB、U73122和TAK-242較大程度地抑制SPPM60-D引起的巨噬細(xì)胞RAW

6、264.7胞內(nèi)自由鈣離子濃度的升高，LY294002和Verapamil能部分抑制SPPM60-D引起的巨噬細(xì)胞RAW264.7胞內(nèi)自由鈣離子濃度的升高，低分子肝素鈉可以完全抑制SPPM60-D所引起的巨噬細(xì)胞RAW264.7胞內(nèi)自由鈣離子濃度的升高，并且會(huì)使其低于空白對(duì)照組胞內(nèi)自由鈣離子濃度。
　　四、通過檢測小鼠巨噬細(xì)胞粘附遷移能力、吞噬能力、分泌的主要的細(xì)胞因子（TNF?α、IL-1、IL-6）及重要炎癥介質(zhì)（NO、NO合酶

7、）的情況來探究PPM60-D及SPPM60-D對(duì)巨噬細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)能力。同時(shí)結(jié)合小鼠巨噬細(xì)胞表面的主要多糖受體TLR4的抑制劑（TAK-242），探究Toll樣受體4（TLR4）在多糖作用于巨噬細(xì)胞中的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，SPPM60-D能顯著的促進(jìn)小鼠巨噬細(xì)胞分泌重要的炎癥介質(zhì)和主要細(xì)胞因子，而且作用效果比陽性對(duì)照（LPS）要強(qiáng)。PPM60-D也有一定程度的促進(jìn)作用但是作用效果不是很明顯。用TLR4的抑制劑TAK242作用后，發(fā)現(xiàn)明顯