1、哈氏噬纖維菌(Cytophaga hutchinsonii)是廣泛存在于自然界中的一類可徹底降解結晶纖維素的好氧細菌,在降解纖維素方面有著快速、徹底等特點。
　　 哈氏噬纖維菌降解纖維素的機制十分特殊,與真菌和厭氧細菌的纖維素降解機理明顯不同。哈氏噬纖維菌降解纖維素的首要條件是與纖維素的直接接觸。其菌體表面不存在纖維小體,也不分泌胞外纖維素酶。所編碼的絕大部分纖維素酶類都不含有碳水化合物結合結構域(CBMs),也不含有類似于纖維

2、小體中dockingdomain的結構域。這些特點顯示哈氏噬纖維菌吸附降解結晶纖維素具有獨特性,此類研究目前在國內外幾乎都是空白。
　　 為了揭示哈氏噬纖維菌的纖維素吸附機制,本文對影響其吸附纖維素的各種因素進行了初步研究,并推測參與吸附的主要成分:包括菌體對不同底物吸附能力的比較,菌體代謝活性對纖維素吸附的影響,表面蛋白及多糖對吸附的影響,以及纖維素類似物對吸附的抑制作用等。
　　 研究結果發(fā)現哈氏噬纖維菌對結晶纖維素

3、的吸附具有很強的特異性,不受菌體代謝活性的影響,吸附作用也不受纖維二糖和羧甲基纖維素的競爭性抑制;而菌體表面蛋白與纖維素吸附密切相關;多糖成分對吸附作用影響較小。實驗結果表明,哈氏噬纖維菌中可能存在有特異性的微晶纖維素吸附蛋白。基于這些研究結果,本文開展了哈氏噬纖維菌細胞表面與纖維素吸附相關的蛋白的進一步研究。
　　 鑒于蛋白在吸附過程中的重要作用,本文通過直接提取的方法,尋找哈氏噬纖維菌中纖維素結合蛋白,這類蛋白的分離鑒定對于

4、研究哈氏噬纖維菌吸附纖維素的機理具有重要意義。經SDS-PAGE分離吸附在微晶纖維素上的天然膜蛋白,并通過蛋白質譜鑒定,總共得到13種哈氏噬纖維菌的纖維素結合蛋白,包括三種滑動相關蛋白,五種假定蛋白,一種外膜脂蛋白,一種β-葡萄糖苷酶,一種ATP合成酶亞基,一種熱激蛋白GroEL以及一種肽脯氨酰順反異構酶,并對這些蛋白進行生物信息學的分析,包括其信號肽及跨膜結構預測等。
　　 為實現對哈氏噬纖維菌纖維素結合蛋白的功能性研究,基于

5、在大腸桿菌中難以獲得活性表達,本文考慮構建哈氏噬纖維菌表達體系,通過同源表達并分離純化纖維素結合蛋白,進而開展更深入的研究。由于哈氏噬纖維菌遺傳操作系統(tǒng)的不完善,本文通過實驗室構建的自主復制質粒來建立哈氏噬纖維菌的表達體系。該質粒以紅霉素為篩選標記,以綠色熒光蛋白或β-半乳糖苷酶為報告基因,實驗證明了這種質粒能在哈氏噬纖維菌中表達。同時,比較幾種不同的啟動子啟動蛋白表達的能力強弱,發(fā)現其中CHU_1284的啟動子是最強的啟動子。