1、研究背景:
　　卵巢癌是婦科常見的生殖道惡性腫瘤，死亡率居婦科腫瘤之首，嚴重威脅了廣大女性的健康和生命。疾病的早期診斷困難以及復發(fā)、轉(zhuǎn)移所致的治療手段缺乏，是卵巢癌死亡率居高不下的主要原因。卵巢透明細胞腫瘤是上皮性卵巢腫瘤中的一種，絕大部分為惡性腫瘤，約占卵巢上皮性癌的5％，在東方女性中較西方更為常見。卵巢透明細胞癌雖較少見，但因具有對化療不敏感、易耐藥、早期復發(fā)、預后差的特點，引起了婦科腫瘤研究者的廣泛關注。
　　賴氨酰氧

2、化酶(Lysyl oxidase，LOX)是細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)中催化膠原與彈性蛋白聚合的關鍵酶。研究表明LOX可調(diào)節(jié)細胞移動，參與基因調(diào)節(jié)、細胞分化、生長調(diào)控及促使正常細胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化等。近期研究發(fā)現(xiàn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，細胞的分化、生長控制、黏附性、活性、惡性轉(zhuǎn)化及侵襲性等均與細胞外基質(zhì)中LOX的異常表達密切相關。目前認為LOX可能具有雙重作用，既是腫瘤抑制因子，同時也很可能是腫瘤轉(zhuǎn)移的促進因子

3、。之前很多文獻報道LOX在不同類型的腫瘤細胞系和原發(fā)性腫瘤中的表達出現(xiàn)紊亂，令人感興趣的是，LOX在不同類型腫瘤中表達改變也不相同，在病理狀態(tài)下LOX的表達出現(xiàn)上調(diào)或下調(diào)的情況均有報道。然而，LOX在卵巢癌中，尤其是卵巢透明細胞癌中的表達及生物學功能仍不明確。
　　microRNA是一類內(nèi)源性、非編碼、單鏈小分子RNA，通過促進靶基因mRNA降解和（或）抑制其翻譯，在轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮調(diào)控基因表達的作用。microRNA的異常表達與腫

4、瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關，其異常表達導致腫瘤細胞無限增殖、凋亡抑制，并促進腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移，同時也是腫瘤細胞間質(zhì)重塑和腫瘤血管生成的重要因素。研究表明microRNA具有很好的組織特異性，并且其表達在腫瘤發(fā)生、發(fā)展的各個階段也具有差異性，這提示我們可以使用microRNA作為腫瘤早期診斷及病情監(jiān)測的標志物。近年來，關于卵巢癌中microRNA功能的研究越來越多。結(jié)論表明，多種microRNA參與卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展。有些是作為原癌基因發(fā)揮促

5、進腫瘤細胞增殖、侵襲以及轉(zhuǎn)移的作用，而有些則作為抑癌基因發(fā)揮抑制腫瘤發(fā)生、發(fā)展的作用。
　　通過生物信息學預測，我們發(fā)現(xiàn)miR-29b可能是能夠轉(zhuǎn)錄后調(diào)控LOX的microRNA。現(xiàn)有研究表明，miR-29b的表達在乳腺癌，肝癌，前列腺癌等多種腫瘤中均呈不同程度下調(diào)，并且參與了結(jié)腸腺瘤向結(jié)腸癌發(fā)展的早期過程，提示miR-29b在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中可能作為抑癌因子發(fā)揮作用。另有研究發(fā)現(xiàn)，miR-29家族與細胞凋亡關系密切，通過誘

6、導細胞凋亡促進乳腺癌和結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展，也可在膽管癌細胞中通過抑制Mcl-1的表達增加細胞對TRAIL的凋亡敏感性，從而促進腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。目前miR-29的研究已涉及多種腫瘤，microRNA表達譜顯示，miR-29在卵巢癌中失調(diào)表達，但其發(fā)揮生物學功能的具體分子生物學機制仍不清楚。
　　綜上所述，研究LOX在卵巢透明細胞癌中的功能，篩選出在卵巢透明細胞癌中能夠?qū)OX作為靶基因的microRNA，并探究其發(fā)揮生物學功能的機

7、制，將為LOX有可能成為卵巢透明細胞癌治療和預防轉(zhuǎn)移的新靶點提供理論基礎。
　　研究目的:
　　(1)檢測卵巢透明細胞癌組織、癌旁組織以及多種卵巢癌的細胞系中LOX的表達。
　　(2)檢測過表達LOX對卵巢透明細胞癌細胞增殖能力和侵襲能力的影響，確定LOX的生物學功能。
　　(3)篩選并證實在卵巢透明細胞癌中能夠調(diào)控LOX的microRNA，并分析其與LOX表達量之間的關系。
　　(4)檢測miR-29b異

8、常表達對卵巢透明細胞癌細胞增殖能力和侵襲能力的影響。
　　研究方法:
　　1.收集27例外科切除手術所得的卵巢透明細胞癌組織及癌旁組織標本，使用免疫組化法對癌組織標本及癌旁組織標本中LOX的蛋白表達水平進行檢測，統(tǒng)計分析不同組織中LOX的陽性表達率，進行分析。此外，體外培養(yǎng)多種卵巢癌細胞系，例如人卵巢透明細胞癌細胞ES-2，人卵巢上皮細胞癌細胞OV-1063，人卵巢腺癌細胞SKOV3和人卵巢腺癌細胞OVCAR-3，以正常卵巢

9、上皮細胞為陰性對照，使用Western blot法檢測細胞中LOX的蛋白表達水平。
　　2.將LOX的編碼區(qū)構(gòu)建到pcDNA3骨架質(zhì)粒上，建立pcDNA3-LOX過表達質(zhì)粒，并將該過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至ES-2細胞中，用Western blot法驗證過表達效率。瞬時轉(zhuǎn)染LOX過表達質(zhì)粒24小時(24 h)、48小時(48 h)和72小時(72 h)后，使用CCK-8法檢測過表達LOX對細胞增殖能力的影響。瞬時轉(zhuǎn)染LOX過表達質(zhì)粒48 h

10、后，使用Transwell法檢測過表達LOX對細胞侵襲能力的影響。
　　3.通過生物信息學網(wǎng)站Targetscan尋找并篩選可能的microRNA。使用實時定量PCR法對ES-2，OV-1063，SKOV3和OVCAR-3幾種卵巢癌細胞中miR-29b的表達譜進行檢測，并與LOX的表達譜進行比較，進一步明確miR-29b與LOX表達之間的關系。將LOX基因mRNA3'UTR區(qū)構(gòu)建到pMIR-REPORTTM質(zhì)粒上形成Luc-LOX

11、3'UTR WT質(zhì)粒，進行熒光素酶報告實驗，并將Luc-LOX3'UTRWT質(zhì)粒上與miR-29b互補配對的位點進行突變，成為Luc-LOX3'UTR Mut質(zhì)粒，與正常的Luc-LOX3'UTR質(zhì)粒組進行比較，明確LOX是否為miR-29b的靶基因。使用Western blot法檢測改變miR-29b的表達水平是否能夠影響內(nèi)源性LOX蛋白的表達水平。
　　4.將miR-29b激動劑Mimics、miR-29b抑制劑Inhibit

12、or以及陰性對照Scramble轉(zhuǎn)染至ES-2細胞中，并用實時定量PCR法驗證過表達和敲低效率。使用CCK-8法檢測Mimics組、Inhibitor組及Scramble組中細胞增殖能力的改變。使用Transwell法檢測Mimics組、Inhibitor組及Scramble組中細胞侵襲能力的改變。
　　結(jié)果:
　　1.檢測卵巢透明細胞癌、癌旁組織及多種卵巢癌細胞系中LOX的表達:
　　1.1免疫組化檢測卵巢透明細胞癌

13、、癌旁組織中LOX的表達:
　　卵巢透明細胞癌癌旁組織中可以檢測到明顯的LOX表達，而卵巢透明細胞癌組織中均未檢測到強表達。LOX陽性產(chǎn)物為棕黃色顆粒，27例卵巢透明細胞癌癌旁組織中表達陽性23例(85.2％)，表達陰性為4例(14.8％)。而在卵巢透明細胞癌組織中表達陽性3例(11.1％)，表達陰性為23例(88.9％)。
　　1.2 Westernblot法檢測多種卵巢癌細胞系中LOX的表達:
　　在正常卵巢上皮細

14、胞中，LOX蛋白呈現(xiàn)較高的表達水平。在人卵巢透明細胞癌細胞ES-2，人卵巢上皮細胞癌細胞OV-1063，人卵巢腺癌細胞SKOV3和人卵巢腺癌細胞OVCAR-3中LOX蛋白表達水平則明顯降低。
　　2.LOX過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染卵巢癌細胞后細胞增殖、侵襲能力的變化:
　　轉(zhuǎn)染LOX過表達質(zhì)粒24小時(24h)、48小時(48h)和72小時(72 h)后，ES-2細胞增殖能力受到明顯抑制。轉(zhuǎn)染LOX過表達質(zhì)粒48小時后，ES-2細胞的

15、侵襲能力受到明顯抑制。差異有統(tǒng)計學意義，p＜0.05。
　　3.熒光素酶報告系統(tǒng)及Western blot驗證miR-29b對LOX表達的調(diào)控:
　　ES-2中miR-29b出現(xiàn)異常高表達，而OV-1063、SKOV3和OVCAR-3中miR-29b未見有異常表達。將Luc-LOX3'UTR WT與Luc-LOX3'UTR Mut分別轉(zhuǎn)染至ES-2和SKOV3巾，miR-29b表達較高的ES-2細胞中，Mut組熒光素酶活性較

16、WT組明顯升高;而在miR-29b表達較低的SKOV3細胞中，Mut組和WT組熒光素酶活性大致相等。將Luc-LOX3'UTR WT與Luc-LOX3'UTRMut分別轉(zhuǎn)染至Hela細胞中，再同時過表達miR-29b，則Luc-LOX3'UTR WT組中過表達miR-29b能夠有效地降低熒光素酶活性，而Luc-LOX3'UTR Mut組中則無明顯改變。差異有統(tǒng)計學意義，p＜0.05。
　　4.miR-29b過表達及敲除實驗檢測mi

17、R-29b對卵巢透明細胞癌細胞增殖、侵襲能力的影響:
　　轉(zhuǎn)染構(gòu)建miR-29b過表達和敲低體系。CCK-8法結(jié)果顯示，Mimics組細胞增殖能力與Scramble組相比并未見明顯變化;而Inhibitor組中ES-2細胞的增殖能力受到明顯抑制。Transwell法結(jié)果顯示，Mimics組細胞侵襲能力與Scramble組相比并未見明顯變化;而Inhibitor組中ES-2細胞的侵襲能力受到明顯抑制。差異有統(tǒng)計學意義，p＜0.05。