1、[研究背景]
　　再生障礙性貧血（再障，aplastic anemia，AA）是一種由多種病因引起的獲得性骨髓衰竭綜合征，臨床表現(xiàn)為不同程度的全血細胞減少所致的貧血、出血和感染，尤其是重型再障，起病較急，進展迅速，重度貧血、臟器出血以及嚴重感染發(fā)生率高，嚴重威脅患者的生命安全，是難治性血液系統(tǒng)疾病之一。再障發(fā)病呈世界性分布，國內發(fā)病率遠高于西方國家，并以中青年居多。再障發(fā)病機制復雜，呈明顯異質性和重疊性，主要概括為“種子”“土壤”

2、和“蟲子”三個方面:“種子”造血干細胞缺陷，包括造血干細胞量的減少和質的缺陷;作為“土壤”的造血微環(huán)境異常，包括骨髓基質細胞和造血生長因子的異常;而“蟲子”則代表紊亂的免疫功能，異?；罨腡細胞及其分泌的細胞因子使造血干細胞凋亡增多;此外某些遺傳因素也被認為與再障的發(fā)病有關。近年來，隨著免疫學以及細胞遺傳學等技術的發(fā)展，再障的發(fā)病機制的研究獲得長足進步，目前普遍認為獲得性再障是一種T細胞異?；罨瘜е碌淖陨砻庖咝约膊?，免疫攻擊的靶細胞主要

3、是骨髓中的造血干/祖細胞。除此以外，許多潛在的自身抗原能夠誘導異常的免疫反應進而攻擊造血干/祖細胞，其相應的自身抗體已被大量檢測到，提示B細胞介導的體液免疫在再障發(fā)病中也起到一定作用。
　　MicroRNA(miRNA)是一類序列高度保守的，長度約為19～25個核苷酸的內源性非編碼單鏈小分子RNA，通過和靶基因信使RNA(mRNA)堿基配對引導沉默復合體降解mRNA或阻遏其翻譯，從而對基因進行轉錄后表達的調控，參與生命過程中的許多

4、重要進程，包括早期發(fā)育、細胞增殖、細胞凋亡、細胞分化以及脂肪代謝等。隨著生物信息學的發(fā)展，越來越多的miRNA分子及其作用被發(fā)現(xiàn)，其中miR146a和miR182分別在固有免疫和適應性免疫方面發(fā)揮著重要的調節(jié)作用。既往研究表明在一些自身免疫性疾病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風濕性關節(jié)炎等，許多異常表達的miRNA通過作用于其靶基因參與疾病的發(fā)生發(fā)展，而miRNA與再障的相關性研究少有報道。本課題中我們首先收取3個重型再障患者和3個健康對照的骨髓

5、T細胞，應用miRNA芯片技術篩選出兩組中差異表達的miRNA，經擴大樣本量驗證后得出miR34a表達量在再障骨髓T細胞中明顯升高，進而進行功能實驗并建立再障的動物模型，探討miR34a及其靶基因在再障發(fā)病機制中的作用，明確miR34a介導T細胞活化的分子機制，為近一步闡明再障的免疫發(fā)病機制以及再障的靶向治療提供了理論依據(jù)。
　　人白細胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)-G是一種非經典的HLAⅠ類基因

6、，不同于經典的HLAⅠ類基因，HLA-G表現(xiàn)為低度多態(tài)性，其編碼蛋白主要存在于母胎界面的滋養(yǎng)層細胞、胸腺、角膜、胰腺以及紅系祖細胞和內皮前體細胞。HLA-G分子有七種異構體，包括4種膜表面蛋白和3種可溶性蛋白，通過直接作用于表達其抑制性受體免疫球蛋白樣轉錄子（immunoglobulin-like transcripts，ILTs）的細胞發(fā)揮免疫抑制效應，誘導免疫耐受。ILTs主要包括三種:ILT2(LILRB1/CD85j), ILT

7、-4(LILRB2/CD85d)和KIR2DL4(CD158d)，其中ILT2主要見于NK細胞、淋巴細胞和樹突狀細胞，ILT4主要見于單核細胞、樹突狀細胞和巨噬細胞。近年來隨著研究深入，HLA-G/ILTs的免疫抑制作用受到越來越多的關注，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)在器官移植、腫瘤、病毒和細菌感染以及自身免疫性疾病等病理情況下HLA-G蛋白表達異常，影響T、B、NK等免疫細胞的正常作用，從而誘導免疫耐受和腫瘤的免疫逃逸等。再障是一種免疫紊亂導致的造血衰竭

8、綜合征，目前尚無文獻報道HLA-G是否參與再障發(fā)生發(fā)展，本課題通過檢測再障患者骨髓和外周血細胞中HLA-G及其受體的表達情況，初步探討HLA-G/ILTs在再障免疫紊亂中發(fā)揮的作用，有可能為再障的免疫機制研究開辟新的領域。
　　第一部分:AA中miR34a/DGKζ增強骨髓T細胞活化的作用及機制研究
　　研究目的:
　　通過miRNA芯片技術篩選出AA骨髓T細胞中異常表達的miRNA分子，擴大樣本量驗證該miRNA分子

9、的表達量，分析其與臨床特征的關系，通過臨床標本檢測以及建立再生障礙性貧血的動物模型，明確該miRNA分子在AA骨髓T細胞活化中的作用，近一步確定該miRNA的靶基因并探討其參與T細胞活化的分子機制，從而為AA的免疫機制研究提供新的思路。
　　研究方法:
　　1.標本采集:收集49例AA患者和28例健康對照的骨髓標本，其中49例AA患者中包括33位重型再障患者和16位非重型再障患者。
　　2.篩選miRNA分子:取3例重

10、型再障患者和3例健康對照的骨髓單個核細胞，經免疫磁珠分選出CD3+T細胞，應用miRNA芯片技術篩選兩組骨髓CD3+T細胞中差異表達的miRNA分子。
　　3.驗證芯片結果:實時熒光定量聚合酶鏈式反應(Real-time PCR)法檢測骨髓單個核細胞中miR34a的表達情況，并分析miR34a與再障患者臨床特征的相關性。
　　4.確定miR34a在骨髓na(i)ve T細胞的表達情況:免疫磁珠分選8例重型再障患者和8例正常人

11、na(i)ve T和non-na(i)ve T細胞，應用PCR檢測na(i)ve T和non-na(i)ve T細胞在兩組中的表達量，明確miR34a表達量升高并非AA骨髓T細胞活化所致的反應性升高。
　　5.確定miR34a在AA中發(fā)揮作用的靶基因:應用PCR及免疫印跡法(westernblot)檢測miR34a可能的靶基因二酯酰甘油激酶(diacylglycerol kinase，DGK)ζ在骨髓單個核細胞的表達水平，并分析m

12、iR34a和DGKζ表達相關性。
　　6.體外功能實驗探究miR34a在AA骨髓T細胞活化中的作用
　　6.1慢病毒轉染AA骨髓單個核細胞:將含有miR34a抑制序列和無義序列的慢病毒轉染AA骨髓單個核細胞，5天后收集細胞后在熒光顯微鏡下觀察并用流式細胞術檢測慢病毒轉染效率。
　　6.2流式細胞術檢測T細胞活化:收集細胞后標記CD4和CD8以及T細胞活化的標志分子CD25和CD69，比較兩組中CD4+和CD8+T細胞的

13、活化水平。
　　7.比較miR34a基因敲除小鼠(miR34a-/-)和正常野生小鼠(wild-type，WT)在骨髓造血系統(tǒng)的區(qū)別:進行外周血細胞和骨髓造血干/祖細胞計數(shù)，同時流式細胞術檢測兩組外周血、骨髓、脾臟、淋巴結等處的CD4+和CD8+細胞的比例。
　　8.小鼠體外功能試驗探究miR34a在T細胞活化中的作用:取miR34a-/-和WT小鼠的脾臟和淋巴結細胞于細胞培養(yǎng)板中，加入anti-CD3和anti-CD8 m

14、Abs刺激T細胞活化，比較兩組T細胞活化狀態(tài)、增殖情況以及下游信號分子的表達水平。
　　8.1 T細胞表面活化標志檢測:應用流式細胞術檢測T細胞表面CD25和CD69的表達水平。
　　8.2 T細胞增殖檢測:應用流式細胞術直接檢測兩組T細胞Brdu的摻入率以及CFSE標染后應用流式觀察細胞分裂以明確miR34a對T細胞增殖的影響。
　　8.3 T細胞活化信號通路中分子檢測:應用western blot檢測兩組細胞中DG

15、Kζ的表達量以及下游信號分子ERK的磷酸化水平。
　　9.構建再障的動物模型:將miR34a-/-和WT小鼠的淋巴結細胞經尾靜脈注入經亞致死量照射的半相合受體鼠，監(jiān)測小鼠血常規(guī)變化，12天后比較兩組小鼠骨髓造血情況以及T細胞增殖情況。將小鼠股骨進行石蠟包埋切片后HE染色觀察骨髓增生情況，應用流式細胞術檢測兩組小鼠骨髓中造血干/祖細胞比例和數(shù)量，同時檢測兩組中T細胞的比例。
　　結果:
　　1.芯片結果:應用芯片技術在重

16、型再障和健康對照骨髓T細胞之間篩選出31個表達明顯差異的miRNA分子，其中16個過表達而15個表達水平降低。
　　2.驗證芯片結果:RT-PCR檢測miR34a表達量在AA中明顯升高，且在重型再障組和非重型再障組之間差別較大。同時miR34a水平與再障患者的外周血中性粒細胞數(shù)和網織紅細胞計數(shù)均成反比。但在AA組中miR34a水平在na(i)veT細胞和non-na(i)ve T細胞之間無明顯差別。
　　3.確定靶基因:參照

17、既往文獻報道和生物信息學軟件分析，選取7個基因作為候選基因，其中DGKζmRNA水平在AA組中明顯低于健康對照組且與 miR34a水平成負相關，AA骨髓單個核細胞中DGKζ蛋白含量亦明顯降低。同時AA組骨髓T細胞表達CD69水平明顯高于對照組。
　　4.下調再障骨髓T細胞中miR34a的表達量使T細胞活化水平降低:轉入miR34a抑制序列的再障骨髓T細胞表達DGKζ明顯增多，其表面CD69和CD25表達量明顯降低。
　　5.

18、MiR34a-/-小鼠和野生型小鼠骨髓造血細胞量的比較:miR34a-/-小鼠外周血和骨髓中CD4+T細胞的比例較野生小鼠明顯降低，而在外周血各系細胞數(shù)、骨髓有核細胞數(shù)、骨髓造血干/祖細胞數(shù)以及CD4+T細胞和CD8+T細胞在脾臟和淋巴結等處的比例在兩組均無明顯差別。
　　6.MiR34a-/-小鼠的體外功能實驗證明miR34a敲除能夠顯著降低小鼠T細胞的活化水平和增殖能力:小鼠淋巴結細胞在體外經anti-CD3和anti-CD8

19、 mAbs刺激后，miR34a-/-組T細胞表面的CD69和CD25水平較野生組明顯降低，Brdu摻入率亦明顯減低，CFSE染色顯示miR34a-/-組細胞分裂率明顯低于野生組。除此以外，作為降解二脂酰甘油(diacylglycerol，DAG)的重要激酶DGKζ在T細胞活化以后明顯降低，但在miR34a-/-組其降低幅度明顯小于野生組，同時T細胞活化信號通路中的下游分子ERK的磷酸化水平在MiR34a-/-組明顯低于對照組。
　

20、　7.再障動物模型中miR34a敲除使T細胞功能減弱:應用野生型和miR34a敲除的淋巴結細胞均可成功構建再障動物模型，兩種淋巴細胞均可在受體鼠骨髓中攻擊造血干/組細胞，但在miR34a-/-組受體鼠骨髓中造血干/組細胞比例和數(shù)量明顯高于野生組，同時miR34a-/-組骨髓中CD8+T細胞比例明顯低于野生組。
　　結論:
　　1.再障患者和健康對照的骨髓T細胞miRNA表達譜存在明顯差異，提示miRNA分子可能參與AA中T細

21、胞介導的免疫紊亂。
　　2.逆轉AA骨髓T細胞中miR34a的表達水平可以明顯降低T細胞的活化水平。
　　3.再障動物模型的建立更加證明了miR34a基因敲除后T細胞活化增殖能力減弱。
　　4.再障中升高的miR34a通過作用于DGKζ顯著增強了T細胞的活化水平，從而在AA的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，有望成為AA治療的新靶點。
　　關鍵詞: MiRNA;再生障礙性貧血;T細胞活化;miR34a; DGKζ

22、>　　第二部分:AA中HLA-G/ILT2抑制骨髓B細胞生長的作用及機制研究
　　研究目的:
　　明確HLA-G及其受體ILT2、ILT4在AA骨髓和外周血中的表達情況，探究HLA-G/ILT2相互作用對AA骨髓中B細胞的影響以及可能的分子機制，為再障的免疫機制研究提供新的方向。
　　研究方法:
　　1.標本采集:收集46例再障患者和28例正常對照的外周血和骨髓，其中包括31例重型再障患者和15例非重型再障患者，

23、分離血漿、骨髓上清和單個核細胞。
　　2.應用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測再障組和對照組骨髓上清和外周血漿中可溶性HLA-G的水平。
　　3.應用real-time PCR檢測再障組和對照組骨髓和外周血單個核細胞中HLA-G、ILT2和ILT4在轉錄水平的表達量。
　　4.應用流式細胞術檢測再障組和對照組骨髓和外周血單個核細胞表面HLA-G、ILT2和ILT4蛋白的表達量。
　　5.應用流式抗體標染再障患者

24、和健康對照骨髓中CD19+B細胞表面的sIgD和sIgM，以此將CD19+細胞分為祖/前B細胞、未成熟B細胞和成熟B細胞，同時應用流式細胞術檢測ILT2在各群細胞的表達量。
　　6.體外功能實驗:從正常對照骨髓單個核細胞中應用免疫磁珠分選CD19+B細胞，將其種于鋪有OP9基質細胞的培養(yǎng)板中，同時加入細胞因子IL-7、SCF和Flt3-L。實驗組加入重組人HLA-G蛋白或含有高濃度HLA-G的再障患者骨髓上清，通過比較各組B細胞B

25、rdu的摻入率明確HLA-G對B細胞生長的作用。除此之外，應用anti-ILT2和anti-HLA-G中和抗體阻斷HLA-G/ILT2的結合，比較阻斷組和非阻斷組B細胞Brdu摻入率證明HLA-G對B細胞生長的作用。
　　研究結果:
　　1.可溶性HLA-G在再障骨髓上清中明顯高于正常對照組，但在外周血漿中兩組無明顯差別，同時發(fā)現(xiàn)在骨髓上清中可溶性HLA-G水平明顯高于外周血漿，提示可溶性HLA-G在骨髓和外周血中分布不均，

26、在此二處對免疫細胞的作用強度可能不同。
　　2.再障組骨髓單個核細胞中ILT2 mRNA的表達量明顯高于對照組，外周血中無明顯差別;同時外周血和骨髓中ILT4 mRNA的表達量在兩組中無明顯差異。
　　3.再障組骨髓B細胞表達ILT2蛋白的比例明顯高于對照組，CD4+T細胞、CD8+T細胞和CD14+單核細胞表面ILT2、ILT4蛋白水平在兩組無明顯差異，外周血單個核細胞中亦無明顯差異。
　　4.再障骨髓B細胞各亞群比

27、例呈現(xiàn)異常，成熟B細胞比例明顯增高，而原/祖B細胞比例明顯降低;同時各亞群表達ILT2的水平有差異，對照組成熟B細胞表達ILT2水平最高，未成熟B細胞次之，原/祖B細胞最低，而在再障組成熟B細胞表達ILT2水平與對照組無異，而原/祖B細胞和未成熟B細胞表達ILT2明顯增高。
　　5.HLA-G/ILT2相互作用抑制骨髓B細胞的生長:與空白對照相比，與重組人HLA-G蛋白或含有高濃度HLA-G的再障患者骨髓上清共孵育的骨髓B細胞Br

28、du摻入率明顯降低，而應用anti-ILT2或anti-HLA-G抗體干擾HLA-G和ILT2結合的阻斷組B細胞Brdu摻入率明顯高于非阻斷組。同時與富含sHLA-G的再障骨髓上清共培養(yǎng)的正常骨髓B細胞的Brdu摻入率較加入正常對照骨髓上清組明顯下降。
　　結論:
　　1.具有免疫抑制作用的HLA-G及其受體ILT2在再障骨髓中異常表達，提示HLA-G/ILT2可能參與再障免疫紊亂狀態(tài)的發(fā)生發(fā)展。
　　2.體外功能實驗