1、尋求新的保護因子或新的治療策略對心肌細胞(cardiac muscle cell，CM)的保護作用及其機制對于心臟疾病的治療和改善心功能具有重要的意義。雖然對心肌細胞肥大和心室重構(gòu)的研究取得了許多重大的突破性進展，但這眾多的研究成果大多是基于心肌細胞或心室結(jié)構(gòu)本身而開展的，而對心臟神經(jīng)調(diào)控機制對心肌細胞結(jié)構(gòu)和功能的影響尚有待于從更廣和更深的層次開展研究。神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-1β(neuregulin-1β，NRG-1β)可通過激活其酪氨酸激酶

2、受體ErbB2和ErbB4而對神經(jīng)元發(fā)揮多種調(diào)控作用，NRG-1β很可能具備對心臟神經(jīng)發(fā)揮特有的調(diào)控作用的潛能，到目前為止，還沒有發(fā)現(xiàn)NRG-1β通過調(diào)控心臟神經(jīng)而對心肌發(fā)揮調(diào)控作用的報道。有趣的是，NRG-1β還可對心肌細胞直接發(fā)揮重要的調(diào)控功能。鑒于心臟神經(jīng)和心肌細胞均為NRG-1β直接調(diào)控的靶組織，這將使NRG-1β對心功能的調(diào)節(jié)作用機制更為復雜。本課題將基于以上研究背景開展如下一系列實驗研究:首先，研究NRG-1β對培養(yǎng)的新生大

3、鼠心肌細胞的ErbB2和ErbB4受體及其下游的磷酸肌醇-3-激酶(phosphoinositide-3 kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，PKB，Akt)和細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2(extracellularsignal-regulated kinase1/2，ERK1/2)的表達及其激活的影響作用;其次，研究NRG-1β及其相關的信號通路對心肌細胞重要的形態(tài)指標和功能指標的影響作用;最終，利用具

4、有選擇性交感神經(jīng)支配的心肌細胞，研究NRG-1β及其相關的信號通路對神經(jīng)和心肌的雙重調(diào)控作用。通過以上系列研究，以便進一步闡明NRG-1β直接調(diào)節(jié)心肌細胞或通過調(diào)節(jié)其神經(jīng)支配而調(diào)節(jié)心肌細胞的作用及其機制。從而提出不僅通過NRG-1β及其受體信號的活性而直接增強心肌細胞再生能力或功能，而且還可通過NRG-1β及其受體信號系統(tǒng)介導的心臟神經(jīng)調(diào)控作用而進一步增強其對心肌細胞結(jié)構(gòu)和功能的調(diào)控作用的新的治療策略。
　　第一部分：神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白

5、-1β在心肌細胞激活其受體及其下游信號通路的實驗研究
　　NRG-1β對心肌細胞ErbB2和ErbB4受體及其下游的PI3K/Akt和ERK1/2的激活是其發(fā)揮生物學效應的重要途徑。為了研究NRG-1β對心肌細胞ErbB2和ErbB4受體及其下游的信號分子Akt和ERK1/2表達及其激活的影響作用，本課題利用培養(yǎng)的新生大鼠心肌細胞觀察了NRG-1β快速孵育和持續(xù)孵育對這些分子表達和激活的影響作用程度。結(jié)果顯示，NRG-1β急性孵育

6、不會對心肌細胞表面積產(chǎn)生影響，而NRG-1β持續(xù)孵育，則可增加心肌細胞的表面積，有利于心肌細胞的生長發(fā)育;NRG-1β急性孵育雖然不能促進其受體ErbB2和ErbB4及其下游信號分子Akt和ERK1/2的表達，但可顯著提高其磷酸化水平，表明NRG-1β急性孵育可激活其受體及其相關的下游細胞信號轉(zhuǎn)導通路;NRG-1β持續(xù)孵育不僅能促進其受體ErbB2和ErbB4及其下游信號分子Akt和ERK1/2的表達，而且還使其磷酸化水平顯著上升，從而

7、改善心肌細胞的生長狀態(tài);NRG-1β的促心肌細胞生長效應可被PI3K抑制劑LY294002或ERK1/2抑制劑PD98059所阻斷，而不能阻斷NRG-1β的誘導其受體ErbB2和ErbB4表達和磷酸化的效應。以上結(jié)果表明，NRG-1β急性孵育和NRG-1β持續(xù)孵育對心肌細胞具有不同的生物學效應。NRG-1β急性孵育和NRG-1β持續(xù)孵育對其受體ErbB2和ErbB4及其下游信號分子Akt和ERK1/2表達和激活的不同生物學效應揭示了將來

8、利用NRG-1β治療相應的心臟疾患所可能采取的不同治療策略。
　　第二部分：神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-1β改善心肌細胞結(jié)構(gòu)和功能指標的作用
　　參與粗肌絲構(gòu)成的肌球蛋白重鏈(myosin heavy chain，MHC)、能夠激活調(diào)節(jié)性肌球蛋白輕鏈（myosin regulatory light chain，rMLC）的心肌特異的肌球蛋白輕鏈激酶（cardiac-specific myosin light-chain kinase，cM

9、LCK）是調(diào)節(jié)肌節(jié)組裝的重要因子，心肌細胞的主要門控通道L-型鈣通道(L-type calcium channel，LTCC，Cav1.2)是Ca2+進入心肌細胞的主要通道，肌質(zhì)網(wǎng)鈣離子三磷酸腺苷酶或肌質(zhì)網(wǎng)鈣離子泵(sarco(endo)plasmic reticulum Ca2+ ATPases or sarco(endo)plasmicreticulum-Ca2+ pump，SERCA2a)通過將胞質(zhì)內(nèi)Ca2+的轉(zhuǎn)運至肌質(zhì)網(wǎng)(sar

10、coplasmicreticulum，SR)內(nèi)，從而調(diào)節(jié)收縮和舒張循環(huán)的協(xié)調(diào)性。以上指標是影響心肌細胞結(jié)構(gòu)和功能的關鍵因素，為了檢測NRG-1β對這些指標的影響作用及其相關機制，本課題利用培養(yǎng)的新生大鼠心肌細胞，研究了NRG-1β及其相關的信號通路對心肌細胞的這些重要形態(tài)指標和功能指標的影響作用，并深入分析了NRG-1β改善心肌細胞內(nèi)在組分的潛能。結(jié)果顯示，NRG-1β可分別促進培養(yǎng)的心肌細胞代表性結(jié)構(gòu)指標MHC、對心肌細胞內(nèi)的關鍵激酶

11、cMLCK、代表性功能指標L-型鈣通道和SERCA2a的表達，PI3K抑制劑LY294002或ERK1/2抑制劑PD98059可抑制NRG-1β引起的促心肌細胞MHC、cMLCK、L-型鈣通道和SERCA2a表達上調(diào)的作用。這些結(jié)果表明，NRG-1β可有效促進對心肌細胞收縮的基本結(jié)構(gòu)分子和功能分子的表達，從而改善心肌細胞的內(nèi)在組分構(gòu)成，并由此而提高心肌細胞功能的潛在能力，這是NRG-1β將來有可能成為改善心功能的有效治療分子的重要實驗依

12、據(jù)。
　　第三部分：神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-1β增強心肌細胞去甲腺素能命運的潛能
　　心肌細胞的去甲腎上腺素能命運是保證和維持心肌細胞功能的前提，在此基礎上，心肌細胞的功能調(diào)控還有賴于正常交感神經(jīng)的支配。心肌細胞β-腎上腺素能受體（β-adrenergic receptor,β-AR）的表達是心肌細胞的去甲腎上腺素能命運的重要體現(xiàn)，β-AR的激活是交感神經(jīng)支配信號傳遞的必由途經(jīng)。本課題將根據(jù)NRG-1β及其相關的信號通路對神經(jīng)和心肌的

13、雙重調(diào)控作用，建立器官型的頸上神經(jīng)節(jié)(superior cervical ganglion，SCG)組織塊和分散心肌細胞的聯(lián)合培養(yǎng)體系，研究有或沒有交感神經(jīng)支配的培養(yǎng)的心肌細胞，再附加NRG-1β孵育的條件下，心肌細胞去甲腎上腺素能命運潛能的變化。結(jié)果顯示，NRG-1β孵育可使心肌細胞β1-AR和β2-AR的表達水平上調(diào)，而選擇性交感神經(jīng)支配使心肌細胞β1-AR和β2-AR表達水平上調(diào)的效應更加明顯，NRG-1β孵育可進一步增強交感神經(jīng)

14、支配信號對心肌細胞β1-AR和β2-AR表達水平上調(diào)的促進效應;在心肌細胞與交感神經(jīng)元聯(lián)合培養(yǎng)的過程中，應用NRG-1β孵育能夠通過增加交感神經(jīng)元突起的數(shù)目增強交感神經(jīng)信號對心肌細胞支配的效能;PI3K抑制劑LY294002或ERK1/2抑制劑PD98059可抑制NRG-1β引起的促心肌細胞β1-AR和β2-AR表達上調(diào)作用和促神經(jīng)元突起生長的效應。這些結(jié)果表明，NRG-1β具有進一步增強交感神經(jīng)支配信號的促心肌細胞去甲腎上腺素能命運的