1、腫瘤多藥耐藥（multi-drug resistance,MDR）成為腫瘤化療失敗的重要原因，而ATP結(jié)合盒（ATP binding cassette,ABC）轉(zhuǎn)運(yùn)家族蛋白的高表達(dá)引起的藥物外排增加是導(dǎo)致腫瘤MDR的主要原因之一，因此，研發(fā)針對(duì)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白介導(dǎo)的多藥耐藥逆轉(zhuǎn)劑成為克服腫瘤MDR的有效手段。然而，目前針對(duì)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)家族蛋白的三代逆轉(zhuǎn)劑由于其專屬性低、毒性大以及體內(nèi)親和力小等原因均未能成功上市。近年來(lái)，從中藥中篩選出高效低

2、毒的耐藥逆轉(zhuǎn)劑及先導(dǎo)化合物已經(jīng)成為腫瘤MDR研究的熱點(diǎn)。
　　鉤藤生物堿是從臨床常用中藥鉤藤中分離得到的生物堿類成分，其中鉤藤堿（Rhynchophylline,Rhy）、異鉤藤堿（Isorhynchophylline,Irhy）、去氫鉤藤堿（Corynoxeine,Cory）和異去氫鉤藤堿（Isocorynoxeine,Icory）是鉤藤氧化類吲哚生物堿中的主要單體成分，而毛鉤藤堿（Hirsutine,HT）和去氫毛鉤藤堿（Hi

3、rsuteine,HST）是鉤藤非氧化類吲哚生物堿中的主要單體成分。有研究報(bào)道鉤藤生物堿提取物及其單體成分具有抑制多種腫瘤細(xì)胞增殖以及促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡等活性，但在鉤藤生物堿逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥方面的報(bào)道甚少。本研究發(fā)現(xiàn)以氧化吲哚生物堿為主的鉤藤生物堿提取物（U1）和以非氧化吲哚生物堿為主的鉤藤生物堿提取物（U2）及其六個(gè)單體成分均具有逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥活性，并選取毒性較小且逆轉(zhuǎn)活性最佳的異去氫鉤藤堿（Icory）為主要研究對(duì)象，對(duì)鉤藤生物堿逆

4、轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥機(jī)制進(jìn)行深入研究。
　　目的：對(duì)鉤藤生物堿逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥活性進(jìn)行評(píng)價(jià)，篩選出活性較好的單體成分Icory為主要研究對(duì)象，進(jìn)行進(jìn)一步的耐藥活性評(píng)價(jià)，并對(duì)其作用機(jī)制做深入研究，以期為將鉤藤生物堿開發(fā)成為腫瘤多藥耐藥逆轉(zhuǎn)劑或先導(dǎo)化合物提供科學(xué)依據(jù)。
　　方法：
　　1.對(duì)鉤藤生物堿逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥活性的評(píng)價(jià)：
　?。?）采用MTT法分別確定U1、U2、Rhy、Irhy、Cory、Icory、HT和HST

5、在HepG2細(xì)胞和HepG2/ADM細(xì)胞上的非毒劑量；
　　（2）采用MTT法對(duì)U1、U2和六個(gè)單體化合物進(jìn)行腫瘤多藥耐藥逆轉(zhuǎn)活性的初步評(píng)價(jià)，并篩選出逆轉(zhuǎn)活性最佳的鉤藤生物堿單體成分；
　?。?）采用MTT法在ABCB1高表達(dá)細(xì)胞株及其敏感細(xì)胞株上進(jìn)一步對(duì)Icory的逆轉(zhuǎn)活性進(jìn)行評(píng)價(jià)；
　?。?）采用MTT法分別在ABCC1和ABCG2高表達(dá)的細(xì)胞株及其敏感細(xì)胞株上對(duì)Icory的逆轉(zhuǎn)活性進(jìn)行評(píng)價(jià)；
　　2.對(duì)鉤藤

6、生物堿逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥機(jī)制的研究：
　?。?）通過(guò)熒光酶標(biāo)儀及熒光拍照檢測(cè)Icory對(duì)多柔比星（Doxorubicin,DOX）在耐藥細(xì)胞內(nèi)累積的影響；
　　（2）通過(guò)熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)Icory對(duì)耐藥細(xì)胞外排DOX的影響；
　　（3）采用qPCR和Western Blot法檢測(cè)Icory對(duì)ABCB1在mRNA和蛋白表達(dá)的影響；
　?。?）通過(guò)Pgp-GloTM ATPase試劑盒檢測(cè)Icory對(duì)ABCB1 ATPa

7、se活性的影響；
　?。?）運(yùn)用MTT法檢測(cè)Icory耐藥逆轉(zhuǎn)活性的持續(xù)性；
　?。?）采用Docking分子對(duì)接的方法預(yù)測(cè)分析Icory和ABCB1的結(jié)合方式和結(jié)合位點(diǎn)。
　　結(jié)果：
　　1.U1、U2、Rhy、Irhy、Cory、Icory、HT和HST均具有逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥活性，其中Icory的逆轉(zhuǎn)作用最強(qiáng)；
　　2.Icory能夠增加HepG2/ADM和MCF-7/ADR等ABCB1高表達(dá)細(xì)胞對(duì)DO

8、X，長(zhǎng)春新堿（Vincristine, VCR）和紫杉醇（Paclitaxel）等ABCB1底物的抗腫瘤藥物的敏感性，但不增加ABCB1高表達(dá)細(xì)胞株對(duì)非ABCB1底物順鉑（Cisplatin）的敏感性；
　　3.Icory不能增加ABCC1高表達(dá)細(xì)胞株HEK293/MRP1和ABCG2高表達(dá)細(xì)胞株S1-M1-80對(duì)抗腫瘤藥物的敏感性；
　　4.Icory能夠增加DOX在HepG2/ADM和MCF-7/ADR細(xì)胞內(nèi)的累積；

9、r>　　5.Icory能夠抑制HepG2/ADM細(xì)胞對(duì)DOX的外排作用；
　　6.Icory對(duì)ABCB1的表達(dá)量無(wú)明顯影響；
　　7.Icory能夠刺激ABCB1 ATPase的活性；
　　8.Icory的逆轉(zhuǎn)作用依賴于其濃度，不具有持續(xù)性；
　　9.Icory占據(jù)ABCB1底物的重要結(jié)合位點(diǎn)，且和VRP與ABCB1的結(jié)合位點(diǎn)部分重疊。
　　結(jié)論：鉤藤生物堿具有逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥活性，Icory能夠特異性逆轉(zhuǎn)