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![西伯利亞鱘的側(cè)線神經(jīng)丘發(fā)育形態(tài)學(xué)觀察及其相關(guān)基因Sox9,Sox2表達檢測.pdf_第1頁](https://static.zsdocx.com/FlexPaper/FileRoot/2019-2/24/12/a4e081c6-09a9-4d61-ac95-7126f545649b/a4e081c6-09a9-4d61-ac95-7126f545649b1.gif)
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文檔簡介
1、西伯利業(yè)鱘(Acipenser baerii)隸屬鱘形目(Acipenser iformes),鱘科(Acipenser idae),鱘屬(Acipense),為軟骨硬鱗魚,分布于西伯利亞河流和湖泊,是地球上最為古老的物種和魚類之一,因而具極高的進化研究價值。以往西伯利亞鱘的研究主要集中于育種,繁殖和生理生化水平。近年來,西伯利亞鱘胚胎及側(cè)線神經(jīng)發(fā)育分化被學(xué)者所關(guān)注。同大多數(shù)魚類一樣,西伯利亞鱘側(cè)線神經(jīng)的神經(jīng)丘位于其側(cè)線管內(nèi),每一個神經(jīng)
2、丘聚集成百個神經(jīng)細胞,包含有周圍和中樞神經(jīng)通路,有感覺水流、水壓、水溫、聽覺等機能。為了追蹤西伯利亞鱘側(cè)線神經(jīng)發(fā)育過程及其作用的相關(guān)基因,本文對此開展了初步研究,取得了以下結(jié)果:
1、形態(tài)學(xué)研究方面:
為揭示西伯利亞鱘側(cè)線管內(nèi)側(cè)線神經(jīng)丘形態(tài)結(jié)構(gòu)及胚后側(cè)線神經(jīng)丘發(fā)育過程,本研究對西伯利亞鱘(Acipenser baerii)成魚進行石蠟切片并進行HE染色,同時利用熒光染料DiA[4-(4-Diethylamin
3、ostyryl)-1-methylpyridinium iodide]對側(cè)線管內(nèi)側(cè)線神經(jīng)丘毛細胞特異性標記的特點,示蹤了西伯利亞鱘胚后仔魚各時期側(cè)線神經(jīng)丘發(fā)育分化發(fā)育的過程。側(cè)線神經(jīng)丘組織學(xué)石蠟切片結(jié)果顯示:西伯利業(yè)鱘側(cè)線管內(nèi)側(cè)線神經(jīng)丘毛細胞如纖毛狀,呈豎立緊密排列。側(cè)線神經(jīng)丘發(fā)育熒光示蹤結(jié)果表明:出膜3天仔魚眼眶后神經(jīng)基板發(fā)育分化的活動劇烈,出膜10天的仔魚眼眶后方的神經(jīng)基板分化出眼眶上下側(cè)線神經(jīng)丘的兩個分支,同時眼眶后神經(jīng)基板進一步
4、向后分化發(fā)育在眼眶后部形成軀干側(cè)線神經(jīng)丘,但整個側(cè)線神經(jīng)丘還未完全發(fā)育完成,待出膜15天時,眼眶上下和軀干側(cè)線神經(jīng)丘已基本發(fā)育完全,出膜22天的仔魚側(cè)線神經(jīng)丘發(fā)育基本完成。
2、分子生物學(xué)研究方面:
a)為提高繪制西伯利亞鱘側(cè)線神經(jīng)丘發(fā)育相關(guān)基因Sox9和Sox2時空表達譜的可信度和精確度,根據(jù)已發(fā)表的魚類β-actin基因cDNA同源保守區(qū),設(shè)計引物,進而結(jié)合RACE技術(shù)克隆了西伯利亞鱘β-actin基因c
5、DNA全長,序列分析表明西伯利亞鱘β-actin基因cDNA全長1322bp,其包括的137bp的5'端非翻譯區(qū),57bp的3端非翻譯區(qū)和編碼375個氨基酸殘基的1125bp開放閱讀框。與其他物種進行分子進化分析表明,該基因具有極高的保守性,且與斑馬魚,黃顙魚的親緣關(guān)系較近。
b)為揭示西伯利亞鱘Sox9基因在其側(cè)線神經(jīng)丘發(fā)育分化過程中的作用,根據(jù)已發(fā)表的魚類Sox9基因的HMG-box保守區(qū)的序列設(shè)計引物,結(jié)合同源克隆和
6、RACE方法獲得了西伯利亞鱘Sox9基因cDNA全長序列,經(jīng)序列分析表明,所克隆Sox9 cDNA全長1409bp,包括開放閱讀框(ORF)1082bp,5'UTR(非編碼區(qū))為20bp和3'UTR為307bp。1083bp ORF共編碼360個氨基酸,相對分子質(zhì)量為41221.7U.序列分析表明,其與施氏鱘的親緣關(guān)系較近,其次是斑馬魚。借助β-actin作為內(nèi)參基因,經(jīng)實時熒光定量技術(shù)對西伯利亞鱘Sox9在各組織以及在胚胎發(fā)育各時期當(dāng)
7、中的相對表達量檢測發(fā)現(xiàn),該基因的表達具有明顯的組織差異性和時間差異性。其中,胰臟和肌肉組織中表達量相對較低,而腎,腦,肝中的表達量相對較高且差別不大,是胰臟和肌肉表達量的2.3倍和21倍。在胚胎發(fā)育的不同階段Sox9的表達量也有一定變化,在囊胚期、神經(jīng)胚期及心臟形成期,Sox9表達量相對較高,特別是囊胚期和神經(jīng)胚期,其表達量是原腸期的1.8倍和1.6倍。
c)為深入探究西伯利亞鱘Sox2基因在其側(cè)線神經(jīng)丘毛細胞分化再生過程
8、中的作用,借助已發(fā)表的魚類Sox基因的HMG-box保守區(qū)的序列設(shè)計引物,結(jié)合同源克隆技術(shù)獲得了西伯利亞鱘Sox2基因的同源保守區(qū),得到一個長度為768bp的序列,該序列也具較高的保守性,經(jīng)分子進化分析發(fā)現(xiàn)該基因與其他物種的相似性也達到了70%以上。隨后,借助β-actin作為內(nèi)參基因,對Sox2基因在西伯利亞鱘成魚各組織及胚胎發(fā)育各時期進行實時熒光定量PCR檢測,發(fā)現(xiàn)Sox2基因在不同的組織當(dāng)中均有表達。其中,在肝、胰、腎、腦四個組織
9、中表達量差距不大,均處于相對較低的水平,在肌肉組織當(dāng)中,表達量最高,達到了肝臟當(dāng)中的10.4倍。同時檢測表明,Sox2基因雖在西伯利亞鱘胚胎發(fā)育各時期均表達,但表達具明顯的時間差異性。在受精卵期、囊胚期Sox2基因的相對表達量較低,在原腸期、神經(jīng)胚期、視泡形成期和心臟形成期Sox2基因相對表達量達較高,且在心臟形成期達到了最高點。
本研究結(jié)果為今后深入研究西伯利亞鱘側(cè)線發(fā)育過程中的神經(jīng)分化發(fā)育、細胞遷移及其整個過程中特異性
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