1、目的：
　　探討毒性中藥鉤吻配伍玉葉金花減毒機制，以闡明其減毒的科學(xué)內(nèi)涵，為臨床安全合理應(yīng)用提供實驗基礎(chǔ)和理論依據(jù)。
　　方法：
　　1.毒效相關(guān)性實驗:采用小鼠急性毒性實驗，以死亡率為指標(biāo)，優(yōu)選出鉤吻的毒性提取溶劑、鉤吻減毒的最佳配比、鉤吻毒性部位及玉葉金花減毒部位;采用小鼠醋酸扭體實驗、熱板實驗及福爾馬林致痛實驗，考察鉤吻毒/效部位配伍前后的鎮(zhèn)痛作用。
　　2.對藥物轉(zhuǎn)運的影響:運用HPLC色譜法考察鉤吻毒/

2、效部位的穩(wěn)定性;運用UPLC-MS/MS分析鑒定鉤吻毒/效部位;建立Caco-2細(xì)胞轉(zhuǎn)運模型，考察鉤吻毒/效部位的雙向跨膜轉(zhuǎn)運及對P-糖蛋白(P-gp)及多藥耐藥相關(guān)蛋白2（MRP2）轉(zhuǎn)運的影響。
　　3.對藥物轉(zhuǎn)化的影響:采用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)、蛋白免疫印跡、免疫組化等方法，分別考察鉤吻配伍前后對Ⅰ相代謝中CYP2E1、CYP1A2基因與蛋白表達(dá)的影響;對Ⅱ相代謝中GST活力，GST-pi、GSTm1基因與蛋白表達(dá)的影響。

3、>　　結(jié)果：
　　1.毒效相關(guān)性實驗
　　(1)減毒實驗①提取溶劑的確定:隨著乙醇濃度的增加，鉤吻醇取物毒性逐漸增大，90％醇提物小鼠死亡率100％，故確定90％乙醇為其毒性提取溶劑。②減毒的配比優(yōu)選:隨著鉤吻和玉葉金花配比的增加，死亡率下降，配比達(dá)1∶40以上，死亡率不再降低，故選1∶40為最佳配比，并驗證其平均死亡率為23.33±5.78％。③相畏部位研究:鉤吻90％醇提物的四個萃取部位（石油醚、二氯甲烷、醋酸乙酯及水部

4、位）中二氯甲烷部位小鼠死亡率為100％，為其毒性部位;分別和玉葉金花的四個相應(yīng)萃取部位配伍后，死亡率均有所下降，其中玉葉金花水部位死亡率最低，為其減毒部位，二者配伍后平均死亡率較配伍前大幅降低(P＜0.05)。
　　(2)鎮(zhèn)痛實驗①醋酸扭體實驗:與生理鹽水組比，鉤吻配伍前后均能顯著減少15min內(nèi)醋酸所致的小鼠扭體次數(shù)（P＜0.01），且配伍后鎮(zhèn)痛率與劑量呈正相關(guān)。②熱板實驗:鉤吻配伍前后在給藥后30min的痛閾值與生理鹽水組比均

5、有顯著性差異(P＜0.05);其中鉤吻配伍高劑量組在給藥后60min、90min內(nèi)仍有顯著性差異(P＜0.05)。③福爾馬林致痛實驗:與生理鹽水組比，鉤吻配伍前后均使第Ⅱ時相內(nèi)出現(xiàn)的疼痛反應(yīng)持續(xù)時間顯著減少(P＜0.01);鉤吻組、鉤吻配伍高、中劑量組使第Ⅰ時相內(nèi)出現(xiàn)的疼痛反應(yīng)持續(xù)時間顯著減少（P＜0.01）。
　　2.對藥物轉(zhuǎn)運的影響
　　(1)轉(zhuǎn)運前穩(wěn)定性研究①HPLC色譜法穩(wěn)定性分析:鉤吻毒/效部位各色譜峰相對保留時間

6、RSD為0.28％-0.91％，相對峰面積RSD為0.35％-4.02％，在48h內(nèi)基本穩(wěn)定;指紋圖譜共有9個共有峰具有良好的重現(xiàn)性、穩(wěn)定性和特征性，指紋圖譜相似度大于0.93，具有很好的相關(guān)性。②UPLC-MS/MS鑒定分析:鉤吻毒/效部位主要鑒定出6種吲哚類生物堿，分別為gelsemine、koumine、humantenidine、gelsenicine、gelsevirine、humantenine。
　　(2)Caco-

7、2轉(zhuǎn)運實驗①雙向跨膜轉(zhuǎn)運:鉤吻毒/效部位配伍后生物堿humantenidine、gelsenicine、gelsevirine、humantenine AP→BL方向的表觀滲透系數(shù)Papp值均下降，BL→AP方向的Papp值均明顯增加;生物堿humantenidine、gelsenicine、gelsevirine外排比率γ均大于2，即外排明顯。②對P-gp轉(zhuǎn)運的影響:維拉帕米與鉤吻毒/效部位合用后，6種吲哚類生物堿的吸收量、外排量均明

8、顯增加。維拉帕米與配伍后的鉤吻毒/效部位合用后，生物堿humantenidine外排比減少了43.69％; gelsenicine外排比減少了41.42％; gelsevirine外排比減少了36.00％; humantenine外排比減少了8.90％。③對MRP2轉(zhuǎn)運的影響:環(huán)孢素與鉤吻毒/效部位合用后，6種吲哚類生物堿的吸收量、外排量均明顯增加。環(huán)孢素與配伍后的鉤吻毒/效部位合用后，生物堿humantenidine外排比減少了42.

9、32％; gelsenicine外排比減少了40.59％; gelsevirine外排比減少了34.00％;humantenine外排比減少了15.07％。
　　3.對藥物轉(zhuǎn)化的影響
　　(1)對Ⅰ相代謝的影響①對基因表達(dá)的影響:與空白組比，鉤吻毒/效部位各劑量組CYP2E1 mRNA表達(dá)量均極顯著下降（P＜0.01），配伍后表達(dá)量較高劑量上升(P＜0.05);與空白組比，鉤吻毒/效部位各劑量組CYP1A2 mRNA表達(dá)量顯

10、著下降(P＜0.05)，配伍后表達(dá)有所上升，但無統(tǒng)計差異。②對蛋白表達(dá)的影響:WesternBlot法顯示與空白組比，鉤吻毒/效部位各劑量組CYP2E1蛋白表達(dá)均明顯下降（P＜0.05），配伍后表達(dá)量較高劑量上升（P＜0.05）;與空白組比，鉤吻毒/效部位高、中劑量組CYP1A2蛋白表達(dá)明顯下降(P＜0.05)，配伍后表達(dá)量上升，但無統(tǒng)計差異。免疫組化法顯示陽性染色細(xì)胞均呈棕黃色或棕褐色，與空白組比，鉤吻毒/效部位各劑量組CYP2E1陽

11、性細(xì)胞面密度、數(shù)密度均下降（P＜0.01或P＜0.05），配伍后較高劑量組上升(P＜0.01或P＜0.05)。與空白組比，鉤吻毒/效部位各劑量組CYP1A2陽性細(xì)胞面密度均下降（P＜0.01或P＜0.05），配伍后較高劑量組上升（P＜0.05）。
　　(2)對Ⅱ相代謝的影響①對基因表達(dá)的影響:與空白組比，鉤吻毒/效部位各劑量組GSTml mRNA表達(dá)量均極顯著下降(P＜0.01)，配伍后表達(dá)量較高劑量上升(P＜0.05)。與空白組

12、比，鉤吻毒/效部位高劑量GST-pi mRNA表達(dá)量顯著下降（P＜0.05），其它組間無統(tǒng)計差異。②對蛋白表達(dá)的影響:與空白組比，鉤吻毒/效部位各劑量組GSTml蛋白表達(dá)均明顯下降（P＜0.05），配伍后表達(dá)量較高劑量上升（P＜0.05）。與空白組比，鉤吻毒/效部位各劑量組GST-pi蛋白表達(dá)均明顯下降（P＜0.05），配伍后表達(dá)量較高劑量上升，但無統(tǒng)計差異。③對酶活力的影響:與空白組比，鉤吻毒/效部位各劑量組GST酶活力均明顯下降（P

13、＜0.01或P＜0.05），配伍后酶活力較高劑量上升(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　1.鉤吻二氯甲烷部位配伍玉葉金花水部位后既可降低毒性，又能保持鎮(zhèn)痛藥效。
　　2.鉤吻毒/效部位配伍后吲哚類生物堿在Caco-2細(xì)胞模型中的吸收減少，外排增加，其機制為可能存在P-gp、MRP2轉(zhuǎn)運蛋白的誘導(dǎo)劑。
　　3.鉤吻毒/效部位配伍后上調(diào)了Ⅰ相代謝酶CYP2E1、CYP1A2的表達(dá)，增強了Ⅱ相代謝酶GST活性，達(dá)到減毒