1、目的：研究purα蛋白對鋰-匹羅卡品致癇大鼠行為學(xué)、神經(jīng)元凋亡及認(rèn)知功能的影響，探討purα對癲癇發(fā)生的預(yù)防作用及機(jī)制。
　　方法：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇經(jīng)寧夏醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，按照相應(yīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作準(zhǔn)則進(jìn)行。選擇雄性Sparague-Dawley（SD）大鼠。挑選標(biāo)準(zhǔn)為：成年大鼠，6~8周，體重在200~250g之間。飼養(yǎng)條件：避光，適宜的溫度和濕度24小時(shí)晝夜循環(huán)。
　　90只SD大鼠隨機(jī)分為Purα過表達(dá)組、沉默組、對照組

2、共三組，每組30只。每組隨機(jī)選取大鼠，以40mg/kg體重標(biāo)準(zhǔn)腹腔注射1％的戊巴比妥鈉溶液進(jìn)行麻醉。根據(jù)大鼠腦立體定位圖譜，確定大鼠海馬CA1區(qū)（前囟后3.6mm，旁開2.2mm，深度2.5mm），用微量注射器緩慢推注4μL慢病毒懸液(5×108TU病毒顆粒)。對照組按上述同樣方法和坐標(biāo)，注射同等體積生理鹽水完成手術(shù)過程。手術(shù)完畢后將大鼠放回籠內(nèi)單獨(dú)飼養(yǎng)且連續(xù)2天給予腹腔注射青霉素5萬U/d防止感染。
　　注射病毒二周后每組隨機(jī)選

3、取10只大鼠斷頭取腦，剝離出海馬組織，通過和Western Blotting證實(shí)Purα慢病毒已經(jīng)在海馬組織表達(dá)；其余每組20只大鼠用匹羅卡品誘導(dǎo)癲癇；根據(jù)Racine評分標(biāo)準(zhǔn)為依據(jù)來判定癲癇發(fā)作級(jí)別，若癲癇發(fā)作達(dá)到Ⅲ~Ⅴ級(jí)則視為成功。若癲癇未發(fā)作或發(fā)作沒有達(dá)到Ⅲ級(jí)則按要求每30min增加注射一次匹羅卡品，增加劑量為10mg/kg，補(bǔ)充的總注射次數(shù)最多不超過3次。癲癇發(fā)作1小時(shí)后觀察記錄大鼠的行為學(xué)變化，癲癇發(fā)作3d后每組選取10只大鼠

4、進(jìn)行水迷宮實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)共5天，可分為空間搜索實(shí)驗(yàn)及定位巡航實(shí)驗(yàn)兩部分。巡航實(shí)驗(yàn)記錄4天(4次/d)，觀察各組大鼠的空間學(xué)習(xí)能力。第5天進(jìn)行空間搜索實(shí)驗(yàn)，記錄大鼠在規(guī)定時(shí)間內(nèi)穿越平臺(tái)象限的次數(shù)及停留時(shí)間，作為判斷大鼠空間記憶能力參考指標(biāo)。其余每組大鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)取材，一部分?jǐn)囝^剝離腦組織取海馬CA1區(qū)組織進(jìn)行凍存；一部分大鼠行活體灌注取材石蠟包埋；取材進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測Caspase-3表達(dá)水平；通過Western-Blot及免疫組織化學(xué)

5、檢測海馬神經(jīng)元Caspase-3的表達(dá)變化水平。統(tǒng)計(jì)分析使用SPSS20.0軟件比較分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以X士S來表示。用單因素方差分析(One-Way ANOVA)對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)比較，組間比較采用LSD法，當(dāng)各組的方差不齊時(shí)用Dunnett法進(jìn)行均數(shù)間的兩兩比較。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：1.Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)：Purα沉默組癲癇大鼠與其他兩組相比較，逃避潛伏期時(shí)間長，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Pu

6、rα過表達(dá)癲癇組與癲癇模型組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。隨著實(shí)驗(yàn)天數(shù)的增加，各組逃避潛伏期也逐漸呈縮短趨勢，Purα過表達(dá)癲癇組大鼠與其他兩組相比較，縮短趨勢并不明顯。平臺(tái)象限滯留時(shí)間三組之間比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。平臺(tái)象限穿越次數(shù)，Purα過表達(dá)癲癇組大鼠與沉默組相比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與癲癇模型組相比差異則無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2.Purα蛋白在海馬區(qū)域的表達(dá)：海馬CA1區(qū)注射高滴度的Purα慢病毒

7、顆粒2周后，提取海馬組織蛋白，免疫印跡結(jié)果顯示Purα蛋白表達(dá)量在Purα過表達(dá)組表達(dá)明顯增高，沉默組則明顯降低；三組之間比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明Purɑ慢病毒對海馬組織進(jìn)行基因?qū)哟紊系母深A(yù)是成功的。
　　3.癲癇大鼠海馬CA1區(qū)HE染色結(jié)果癲癇誘導(dǎo)成功三天后，海馬形態(tài)及病理改變。癲癇模型組細(xì)胞排列規(guī)則，細(xì)胞結(jié)構(gòu)欠完整。Purα過表達(dá)組，細(xì)胞排列緊密，結(jié)構(gòu)相對完整清晰，染色質(zhì)均勻分布。沉默組，細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂，神經(jīng)元變性壞死，間

8、距加大，存在明顯神經(jīng)元凋亡。
　　4.免疫組織化學(xué)染色：匹羅卡品誘導(dǎo)大鼠癲癇發(fā)作3d后，與癲癇模型組和沉默組相比，Purα過表達(dá)組偶見棕染細(xì)胞、著色較淺；癲癇模型組陽性細(xì)胞較過表達(dá)組多；沉默組，可見大量陽性細(xì)胞，其胞漿和胞核內(nèi)均有棕黃色或棕褐色顆粒沉著。說明Purα對癲癇發(fā)作所導(dǎo)致的海馬神經(jīng)元有保護(hù)作用，沉默Purα基因的表達(dá)，可使得癲癇誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡加重。
　　5.Western-Blot：Caspase-3的表達(dá)水平，