1、第一部分：光滑念珠菌感染大鼠氣道上皮細胞的研究
　　目的：通過建立光滑念珠菌感染大鼠氣道上皮細胞（Rat tracheal epithelia cell，RTEC）的體外模型，觀察光滑念珠菌感染RTEC在不同時間點細胞增殖、周期及凋亡的變化，分別在蛋白和細胞水平檢測 TLR-2、NF-κB（p65）、TNF-α和IL-6表達情況，以探討TLR-2受體介導(dǎo)的NF-κB（p65）信號通路在光滑念珠菌感染RTEC的研究。方法：RTEC感

2、染光滑念珠菌，感染復(fù)數(shù)（Multiplicity of infection, MOI)為1。在0h、2h、4h及6h終止感染，分別采用CCK-8（cell counting kit8，CCK-8）檢測細胞存活率。流式細胞儀檢測在不同感染時間點細胞周期和凋亡變化情況。Western Blot（WB）方法檢測細胞膜表面TLR-2受體及核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB（p65）在不同感染時間點的表達變化。ELISA方法檢測下游細胞因子TNF-α和IL-6

3、在不同感染時間點的分泌情況。結(jié)果：CCK-8法檢測結(jié)果表明，隨著時間的延長，光滑念珠菌感染對RTEC的增殖有明顯的抑制作用。流式細胞儀檢測周期結(jié)果顯示，光滑念珠菌感染細胞能夠使細胞的生長周期阻滯在 G0/G1期，抑制細胞的增殖，從而促進細胞的凋亡。采用 Annexin V-FITC/PI雙染色流式細胞儀檢測細胞凋亡結(jié)果顯示，隨著感染時間的延長，細胞凋亡的比例顯著增加。Western Blot結(jié)果表明，隨著感染時間的延長TLR-2受體與N

4、F-κB（p65）蛋白表達水平顯著增加。ELISA結(jié)果表明， TNF-α和IL-6分泌水平也隨著感染時間的延長而顯著升高。結(jié)論：光滑念珠菌感染RTEC能抑制細胞增殖，降低細胞存活率。在靜息狀態(tài)下TLR-2受體表達水平較低，在光滑念珠菌感染的過程中能啟動 TLR-2受體的表達，并激活核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB（p65），誘導(dǎo)下游細胞因子和炎癥因子TNF-α和IL-6的分泌及表達。這一現(xiàn)象可能在RTEC應(yīng)對光滑念珠菌感染的免疫防御調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮重

5、要的作用。
　　第二部分：siRNA干擾TLR-2受體對大鼠氣道上皮細胞的影響
　　目的：siRNA干擾 TLR-2受體對光滑念珠菌感染大鼠氣道上皮細胞（RTEC）的影響。方法：通過轉(zhuǎn)染siRNA抑制RTEC TLR-2受體（Toll-like receptor2，TLR-2）的表達，構(gòu)建感染模型，采用與第一部分相同的檢測方法，進一步觀察轉(zhuǎn)染后感染光滑念珠菌的RTEC增殖、周期和凋亡變化情況，以及TLR-2受體、核轉(zhuǎn)錄因子N

6、F-κB（p65）、下游細胞因子TNF-α和IL-6的表達變化。結(jié)果：轉(zhuǎn)染TLR-2 siRNA的 RTEC感染光滑念珠菌后進一步抑制細胞的增殖。流式細胞儀檢測周期結(jié)果表明，細胞在 G0/G1生長期的比例增高，細胞生長周期阻滯在 G0/G1期，進一步促進細胞的凋亡。采用Annexin V-FITC/PI雙染色流式細胞儀檢測凋亡結(jié)果顯示，隨著感染時間的延長，細胞凋亡的比例顯著增加。Western Blot及ELISA結(jié)果均表明，轉(zhuǎn)染后TL

7、R-2、NF-κB（p65）、TNF-α和IL-6的表達水平顯著降低。結(jié)論：TLR-2受體可以啟動光滑念珠菌感染RTEC的免疫反應(yīng)，并引起炎癥反應(yīng)，表明是由于TLR-2受體介導(dǎo)的細胞損傷。RTEC啟動TLR-2受體的表達是建立在 TLR-2受體對光滑念珠菌早期識別的基礎(chǔ)上，并通過 TLR-2--NF-κB下游信號通路啟動TLR-2受體的表達。
　　第三部分：NF-KB抑制劑PDTC抑制NF-KB的活性對大鼠氣道上皮細胞的影響

8、>　　目的：探討 NF-KB抑制劑（PDTC）對光滑念珠菌感染大鼠氣道上皮細胞（RTEC）的影響。方法：加入PDTC預(yù)處理RTEC2h后，建立體外感染模型，采用與第一及第二部分相同的檢測方法，進一步觀察加入PDTC后，感染光滑念珠菌的RTEC增殖、周期和凋亡的變化情況，以及TLR-2受體、核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB（p65）、下游細胞因子TNF-α和IL-6的表達變化。結(jié)果：加入PDTC預(yù)處理的RTEC與轉(zhuǎn)染siRNA抑制RTEC TLR-2

9、受體的結(jié)果類似，感染光滑念珠菌后均抑制細胞增殖。流式細胞儀檢測周期結(jié)果表明，細胞在G0/G1生長期的比例增高，細胞生長周期阻滯在 G0/G1期，促進細胞的凋亡。采用Annexin V-FITC/PI雙染色流式細胞儀檢測凋亡結(jié)果顯示，隨著感染時間的延長，細胞凋亡的比例顯著增加。預(yù)處理后的 TLR-2受體、核轉(zhuǎn)錄因子 NF-κB（p65）在前4h表達受到抑制，雖然 NF-κB（p65）在第6h有所升高但也只是達到基線水平，TNF-α和IL-