1、尿酸結石是泌尿系結石中一種常見的類型，其發(fā)病率在許多國家和地區(qū)出現(xiàn)逐年上升趨勢。尿酸結石形成的影響因素眾多但機制尚不明確，目前研究認為高尿酸尿對尿酸結石的形成起著至關重要的作用。尿液中的尿酸水平主要取決于腎小球的濾過與腎小管對它的分泌和重吸收之間的平衡，而腎小管對尿酸的分泌程度直接決定了尿尿酸水平的高低。
　　近年研究發(fā)現(xiàn)，遺傳因素是影響結石形成的眾多因素之一，多個基因已初步被證實與結石的發(fā)生存在密切關系。全基因組關聯(lián)研究（GWA

2、S）表明ABC轉運蛋白超家族 G亞家族第2成員（ABCG2）基因存在多個單核苷酸多態(tài)性（SNP）位點與高尿酸血癥、痛風的發(fā)病相關聯(lián)。而 rs2231142（Q141K）是ABCG2第5個外顯子上的錯義突變位點，該位點突變與高尿酸血癥及痛風的發(fā)生密切相關，尤其在男性表現(xiàn)更為明顯，但是該位點突變與尿酸結石形成的關系尚未見報道。
　　進一步的動物實驗表明 ABCG2基因敲除導致小鼠呈現(xiàn)出腎臟尿酸排泄量明顯增加，腸道排泄尿酸量減少，而體內(nèi)

3、血尿酸水平增加，這提示 ABCG2蛋白在腎外及腎性尿酸排泄過程中都發(fā)揮了重要生理作用。在我們前期實驗中，通過沉默HK-2細胞ABCG2基因，我們發(fā)現(xiàn)該細胞排泄尿酸能力明顯受損，且其他尿酸轉運體并不能代償。由此我們推測 ABCG2基因表達的下調可能是導致腎臟細胞尿酸轉運能力的下降和尿酸分泌減少，繼而誘發(fā)高尿酸尿癥和尿酸結石形成的重要原因之一，但仍需要進一步的實驗驗證。
　　已有研究證實ABCG2基因的遺傳變異可導致ABCG2蛋白的表

4、達下降，進而影響其尿酸轉運功能。因此，了解 ABCG2基因遺傳變異在尿酸結石人群中的分布情況，明確與尿酸排泄相關的SNPrs2231142位點突變在細胞水平及大鼠體內(nèi)對尿酸代謝和尿酸結石形成的影響，從而探明 ABCG2基因遺傳變異在尿酸結石形成過程中的作用及其可能機制，為臨床篩查尿酸結石易感人群和尿酸結石的防治提供新的實驗依據(jù)。
　　目的：
　　1.比較尿酸結石病人及正常非結石體檢人群尿酸代謝相關基因的單核苷酸多態(tài)性位點的分

5、布，進一步探索ABCG2基因SNP rs2231142位點突變與尿酸結石形成的關系；
　　2.分別構建 ABCG2基因沉默 NRK穩(wěn)定細胞株、ABCG2穩(wěn)定過表達及Q141K位點突變的HEK-293細胞株，并檢測ABCG2基因沉默、過表達及Q141K位點突變在細胞水平上對尿酸轉運功能影響；
　　3.采用CRISPR/Cas9技術構建ABCG2基因敲除SD大鼠動物模型，為下一步驗證ABCG2蛋白在體內(nèi)對尿酸轉運影響的機制研究奠

6、定基礎。
　　方法：
　　1.以該院泌尿外科接受手術的尿酸結石患者及體檢中心無結石正常體檢人群為對象分別設立尿酸結石組及正常對照組，比較兩組人群一般資料，提取血液基因組DNA，并用質譜法檢測尿酸轉運相關基因的單核苷酸多態(tài)性（SNP）位點基因型，通過回歸分析研究兩組人群中存在統(tǒng)計學差異的SNP基因型分布以及相對應的等位基因A、T與尿酸結石的發(fā)生的相關性。
　　2.設計合成四對Rat-ABCG2基因沉默序列（shRNA），

7、構建ABCG2-shRNA重組表達載體瞬轉NRK細胞，并采用RT-PCR及Western blot檢測ABCG2表達變化，篩選出最高沉默效率的shRNA序列。將沉默效率最高的ABCG2-shRNA片段插入慢病毒表達載體pLKO.3G質粒，構建ABCG2沉默序列重組慢病毒質粒pLKO.3G-shRNA。
　　3.提取SD大鼠組織RNA， PCR擴增ABCG2基因CDS序列片段，并利用點突變的方法構建ABCG2基因Q141K位點突變C

8、DS序列；分別將ABCG2基因CDS序列及突變CDS序列通過雙酶切法插入慢病毒表達載體pLEX-MCS質粒，構建 ABCG2過表達及點突變重組慢病毒質粒 pLEX-ABCG2和pLEX-mutABCG2。
　　4.利用慢病毒包裝系統(tǒng)分別包裝 ABCG2基因沉默、過表達及位點突變慢病毒液，將攜帶 pLKO.3G-shRNA的慢病毒顆粒感染 NRK細胞；攜帶pLEX-ABCG2及pLEX-mutABCG2的慢病毒液分別感染HEK-29

9、3細胞，嘌呤霉素篩選穩(wěn)定表達細胞株；通過高效液相色譜-質譜聯(lián)用法檢測各組細胞外排尿酸鹽濃度，評估ABCG2基因沉默、過表達及Q141K位點突變對尿酸鹽轉運功能的影響。
　　5.利用CRISPR/Cas9基因靶向技術，構建針對目的基因ABCG2的gRNA，體外轉錄為mRNA，顯微注射法將gRNA/Cas9 mRNA混合物注入SD大鼠的受精卵中，并行胚胎移植至假孕雌鼠；對構建的新生大鼠行基因測序鑒定，并傳代至產(chǎn)生ABCG2基因敲除的S

10、D大鼠。
　　結果：
　　1.本研究共納入尿酸結石患者166例，正常對照164例，兩組人群在性別、年齡方面無統(tǒng)計學差異，但尿酸結石組患者血尿酸濃度明顯高于正常對照組。尿酸結石組SNP rs2231142發(fā)生位點突變的頻率高于正常對照組人群；尿酸結石組與正常對照組相比，A等位基因頻率有顯著性差異；相比CC基因型，CA基因型和AA基因型使尿酸結石發(fā)生的OR分別是2.58（95％CI:1.59~4.18, p<0.001）和4.7

11、6（95%CI:2.27~9.97, p<0.001）；A等位基因與尿酸結石發(fā)生顯著相關OR=2.93，（95%CI:1.85~4.66，p<0.001）。
　　2.半定量RT-PCR及Western blot分析發(fā)現(xiàn)pGP-sh1856瞬轉NRK細胞后， ABCG2基因mRNA及蛋白表達均明顯下降，提示ABCG2干擾序列sh1856有明顯的沉默效率。將該干擾序列通過雙酶切法與慢病毒表達載體pLKO.3G質粒連接后，PCR擴增產(chǎn)物

12、電泳及測序證實連接正確。
　　3.成功釣取 Rat-ABCG2目的基因 CDS序列，并構建 Rat-ABCG2基因CDS序列Q141K位點突變；通過雙酶切方法將Rat-ABCG2目的基因順利插入慢病毒表達載體pLEX-MCS質粒，并成功將GFP基因片段連入重組表達質粒。酶切后 PCR擴增產(chǎn)物電泳及測序鑒定證實 pLEX-ABCG2、pLEX-mutABCG2重組慢病毒表達載體構建成功。
　　4.成功構建ABCG基因沉默的NR

13、K細胞，熒光顯微鏡下表達GFP蛋白的NRK細胞>90%；RT-PCR及Western blot結果顯示pLKO.3G-sh1856轉染組NRK細胞內(nèi)ABCG2 mRNA和蛋白表達水平較對照組NRK細胞明顯下降。液相色譜-質譜對細胞培養(yǎng)液尿酸鹽濃度檢測發(fā)現(xiàn) pLKO.3G-sh1856轉染組 NRK細胞外排尿酸鹽濃度較對照組NRK細胞降低。
　　5.構建成功的 ABCG2過表達及點突變 HEK-293細胞于熒光顯微鏡下觀察，表達GF

14、P蛋白的HEK293細胞>90%；RT-PCR及Western blot結果顯示pLEX-ABCG2、pLEX-mutABCG2轉染組HEK293細胞內(nèi)ABCG2 mRNA和蛋白表達水平增高。液相色譜-質譜檢測顯示pLEX-ABCG2、pLEX-mutABCG2轉染組HEK293細胞外排尿酸鹽濃度較對照組HEK293細胞明顯升高，且 pLEX-mutABCG2轉染組 HEK293細胞外排尿酸鹽濃度約為 pLEX-ABCG2轉染組50%，

15、兩組間差異顯著。
　　6.針對ABCG2第二個外顯子成功設計并合成兩對gRNA及擴增片段引物，經(jīng)顯微注射gRNA/Cas9 mRNA至受精卵雄性原核并胚胎移植孕育后，產(chǎn)生15只首建鼠，經(jīng)提取大鼠組織基因組 DNA，利用特異性引物 PCR擴增后電泳及測序鑒定、篩選得到目的基因特定序列敲除的SD大鼠雜合子，合籠傳代至F2代時獲得目的基因ABCG2敲除的SD大鼠動物模型。
　　結論：
　　1.人群中ABCG2 rs22311

16、42單核苷酸多態(tài)性與尿酸結石形成相關，且CA基因型、AA基因型及A等位基因與尿酸結石發(fā)生呈正相關。
　　2.成功篩選出具有顯著ABCG2沉默效果的shRNA序列，構建了ABCG2基因沉默的NRK穩(wěn)定細胞株，說明pLKO.3G-ABCG2-shRNA可以下調NRK細胞內(nèi)ABCG2基因mRNA及蛋白的表達水平。
　　3.成功構建Rat-ABCG2及其Q141K位點突變的重組慢病毒表達載體，并順利構建穩(wěn)定表達Rat-ABCG2的H

17、EK293細胞株，說明pLEX-ABCG2慢病毒載體能上調HEK293細胞內(nèi)ABCG2基因mRNA及其蛋白的表達水平。
　　4. ABCG2基因沉默的NRK細胞尿酸鹽外排濃度下降，提示ABCG2基因沉默導致了其編碼蛋白的尿酸鹽轉運功能障礙。
　　5. ABCG2過表達能顯著提高HEK293細胞外排尿酸鹽濃度，而ABCG2 Q141K位點錯義突變可降低HEK293細胞尿酸鹽分泌濃度，提示ABCG2基因編碼蛋白對細胞尿酸鹽的分泌