1、第一部分：KLF14基因在心肌肥厚表達和功能的細胞實驗研究
　　【研究目的】
　　心肌肥厚是心臟對慢性壓力或容量超負荷產生的一種代償反應，它的基本變化包括心肌細胞的肥大和非心肌細胞的增殖、增生[1-2]。本部分首先構建KLF14腺病毒，通過異丙腎上腺素（Isoprenaline,ISO）刺激體外培養(yǎng)的新生大鼠原代培養(yǎng)心肌細胞建立肥大模型，然后通過用KLF14腺病毒轉染新生大鼠原代心肌細胞，觀察相關指標的變化，探討KLF14基

2、因在心肌細胞中的表達情況，探討KLF14過表達在心肌細胞肥大的功能，為研究KLF14在動物心肌肥厚中的功能打下堅實基礎。
　　【研究方法】
　　1．大鼠KLF14腺病毒構建
　　1.1大鼠腺病毒重組質粒的構建
　　在NCBI中查詢到大鼠KLF14基因序列，并據此人工合成kLF14對應的基因組片段。配制BamHI和EcoRI雙酶切體系，分別酶切pHBAd-MCMV-RFP載體和KLF14基因并膠回收。取2ul處理好

3、的酶切后KLF14片段，100-200ng酶切后載體，2ulligasebuffer，1ulT4ligase，加滅菌雙蒸水至20ul配成連接液16℃過夜得到pHBAd-MCMV-RFP-KLF14重組質粒。重組質粒經PCR鑒定和測序后通過大腸桿菌擴增。
　　1.2KLF14腺病毒包裝及滴度測定
　　用pHBAd-MCMV-RFP-KLF14重組質粒和pHBAd-BHG骨架質粒，在293細胞中包裝成pHBAd-MCMV-RFP

4、-KLF14腺病毒。大量擴增后收毒，測定陰性對照RFP腺病毒和KLF14腺病毒滴度，分裝后-80℃保存?zhèn)溆谩?br>　　2．心肌細胞肥大時，KLF14表達及功能研究
　　采用體外心肌細胞原代培養(yǎng)技術，培養(yǎng)出生1-3天的SD乳鼠心肌細胞，用ISO刺激誘導心肌細胞肥大模型。設立對照組（給予滅菌蒸餾水）及不同刺激時間的ISO刺激組。采用RT-PCR法比較各組細胞間KLF14mRNA、BNPmRNA的表達變化情況。
　　3．KLF1

5、4過表達在心肌細胞肥大中的功能研究
　　3.1原代培養(yǎng)新生SD大鼠心肌細胞，48h后轉染不同感染倍數(shù)（MOI）KLF14表達腺病毒，使用流式細胞儀及CCK8，檢測細胞轉染率及活力情況以選擇合適轉染倍數(shù)。
　　3.2設置以下分組：①KLF14腺病毒組②KLF14腺病毒+ISO組③RFP腺病毒組④RFP腺病毒+ISO組。采用RT-PCR檢測各組BNPmRNA及KLF14mRNA的表達變化情況。
　　【結果】
　　1.

6、成功構建pHBAd-MCMV-RFP-KLF14過表達質粒，聯(lián)合骨架質粒pHBAd-BHG轉染293T細胞后得pHBAd-MCMV-RFP-KLF14腺病毒，293T細胞中的腺病毒拍照呈紅色熒光。改進的TCID50法計算，構建的pHBAd-MCMV-RFP腺病毒滴度2×1010PFU/ml，pHBAd-MCMV-RFP-KLF14腺病毒滴度1×1010PFU/ml。
　　2.流式細胞學檢查，KLF14腺病毒轉染心肌細胞轉染率。綜合

7、考慮KLF14腺病毒轉染心肌細胞的轉染率和CCK8檢測腺病毒對心肌細胞活力影響，轉染心肌細胞時，我們選擇KLF14腺病毒的MOI=20，RFP腺病毒的MOI=10。
　　3.KLF14在SD乳鼠心肌細胞中低豐度表達。用ISO刺激心肌細胞30分鐘，KLF14基因表達量開始升高，以4h為最高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；刺激24h后KLF14的表達量下降至對照組水平，與對照組無明顯差異。
　　4單純ISO刺激組較對照組的B

8、NPmRNA明顯上調，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。.單純轉染KLF14腺病毒較單純轉染RFP腺病毒BNPmRNA較對照組無明顯變化。KLF14腺病毒聯(lián)合ISO刺激組較單純ISO刺激組（P＜0.05）和RFP腺病毒聯(lián)合ISO刺激組中（P＜0.05）BNPmRNA明顯上調,差異有統(tǒng)計學意義。
　　【結論】生理情況下，KLF14在心肌細胞中低豐度表達。在心肌細胞病理性肥大情況下表達升高，轉染腺病毒表達載體使KLF14在乳鼠心肌細胞

9、中過表達可以促進ISO誘導的心肌細胞肥大加重。
　　第二部分KLF14基因在心肌肥厚中表達和功能的動物實驗研究
　　【研究目的】
　　第一部分實驗明確KLF14基因過表達促進心肌細胞肥大的作用以后，因心肌細胞僅是心肌的部分成分，心肌還含有成纖維細胞等非心肌細胞，另外機體內有復雜的神經體液調節(jié)機制，因此還需要整體實驗來研究KLF14基因在動物心肌肥厚中的表達和功能。本部分皮下埋置預裝ISO的微滲透泵刺激小鼠建立小鼠心肌肥

10、厚模型，KLF14轉基因小鼠實現(xiàn)KLF14過表達，通過與對照組小鼠相比，轉基因小鼠在超聲心動圖，心室組織切片HE染色、WGA染色及RT-PCR時KLF14mRNA等指標變化情況，探討KLF14基因在動物心肌肥厚中的表達和功能情況。
　　【研究方法】
　　1.小鼠心肌肥厚模型的建立
　　野生型FVB小鼠隨機分成兩組，ISO組皮下埋置預裝ISO微泵，PBS對照組皮下埋置預裝等量PBS的微泵，按30mg/kg/d劑量刺激14

11、天，行超聲心動圖及心室組織切片HE染色、WGA染色情況了解心肌肥厚模型是否成立，比較ISO組和PBS組的KLF14mRNA表達情況。
　　2.KLF14在心臟過表達可導致心肌肥厚
　　KLF14轉基因FVB小鼠與野生型FVB小鼠喂食相同的水和飼料，12月后處死后提取心室組織RNA行RT-PCR比較兩組KLF14mRNA表達水平。行超聲心動圖檢查、心室組織切片HE染色、WGA染色了解心室肥厚情況。
　　【結果】
　

12、　1.KLF14在正常心肌組織中低豐度表達。
　　2.與PBS對照組相比，14天后埋泵組ISO組M型超聲心動圖下左心室收縮后壁厚度（LVPWs）、左心室舒張后壁厚度（LVPWd）、左心室收縮前壁厚度（LVAWs）增加（p＜0.05），心室組織切片HE染色示心肌組織增厚，左心室腔變小，心臟出現(xiàn)向心性肥厚，WGA染色示心肌細胞膜表面積增大，差異有統(tǒng)計學意義：說明小鼠心肌肥厚模型造模成功。RT-PCR結果ISO組KLF14mRNA表達量

13、上升，提示心肌肥厚時KLF14表達量上調。
　　3.提取小鼠心室組織RNA行RT-PCR,與野生型組小鼠相比，KLF14轉基因組小鼠較野生型組小鼠KLF14mRNA表達量明顯增高，差異有統(tǒng)計學意義（p＜0.05）。KLF14轉基因小鼠較野生型小鼠超聲心動圖、心肌組織切片HE染色示心肌組織增厚，左心室腔變小，心臟出現(xiàn)向心性肥厚，WGA染色示心肌細胞膜表面積增大，提示KLF14基因過表達對小鼠產生一種類似皮下埋置預裝ISO微泵的功能，