1、背景：
　　近年研究表明，NADPH氧化酶（NADPHoxidase，NOX）在各種組織、器官的纖維化發(fā)病過程中起關鍵作用，是開發(fā)抗纖維化藥物的重要新靶點。NOX激活后產(chǎn)生的活性氧（reactiveoxygenspecies，ROS）介導了肝星狀細胞（hepaticstellatecells，HSCs）內的促纖維化信號轉導，導致肝纖維化形成。值得關注的是，NOX來源的ROS促進HSCs增殖、轉化并存活，卻誘導肝細胞凋亡，進一步加重

2、肝損傷。
　　本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)熊果酸（ursolicacid，UA）具有的獨特的抗肝纖維化作用。體外研究發(fā)現(xiàn)UA能選擇性誘導活化型HSCs（HSC-T6細胞株）凋亡、抑制其增殖，卻不引起肝細胞凋亡，反促其增殖。體內研究表明UA能阻斷脂質過氧化，減輕纖維組織增生，并保護受損的肝細胞，減少其凋亡與壞死，明顯改善肝纖維化大鼠的肝組織結構。但熊果酸在肝纖維化過程中保護肝細胞的分子機制尚不明確。
　　我們假說熊果酸保護肝細胞的機制

3、可能是通過抑制肝細胞的NOX活性減少ROS生成，從而抑制肝細胞凋亡，促進肝細胞再生。本課題以大鼠原代肝細胞為研究對象，以TGF-β1為促纖維化因子，探討熊果酸干預對原代肝細胞NOX活性及ROS生成的影響及其與肝細胞增殖、凋亡的關系。
　　目的：
　　觀察熊果酸干預對TGF-β1誘導的肝細胞增殖、凋亡的影響，及熊果酸干預對TGF-β1誘導的原代肝細胞NOX活性和ROS生成的影響，闡明熊果酸保護肝纖維化過程中肝細胞的可能機制。<

4、br>　　方法：
　　采用原位灌注法分離提取健康雄性SD大鼠的肝細胞，接種培養(yǎng)12-24h，待細胞貼壁生長成條索狀、島狀，占總面積80％以上時，隨機分成以下各組：空白對照組、熊果酸對照組（25uM/L）、TGF-β1組（2.5ng/ml）、熊果酸干預組（熊果酸25uM/L+TGF-β12.5ng/ml）、DPI干預組（DPI0.5uM/L+TGF-β12.5ng/ml）、Rosup陽性對照組（10uM/L）。原代肝細胞經(jīng)藥物作用3

5、0min后采用Western-blotting檢測肝細胞內NOX亞基p47phox向胞膜移位的情況；經(jīng)藥物作用1小時后采用活性氧檢測試劑盒檢測肝細胞內ROS水平；經(jīng)藥物作用6小時后采用熒光定量PCR檢測肝細胞內CD95mRNA的表達；經(jīng)藥物作用12小時后采用流式細胞儀檢測肝細胞增殖、凋亡情況，采用Western-blotting檢測肝細胞內CD95蛋白的表達。
　　結果：
　　1.熊果酸干預對TGF-β1刺激后肝細胞增殖、凋

6、亡的影響
　　1.1熊果酸干預對TGF-β1刺激后肝細胞增殖的影響
　　肝細胞經(jīng)TGF-β1作用12h后，其增殖指數(shù)比空白對照組明顯下降（P<0.01）；熊果酸對照組的肝細胞增殖指數(shù)要顯著高于空白對照組（P<0.01）；熊果酸干預組的肝細胞增殖指數(shù)較TGF-β1組明顯增加（P<0.01），與DPI干預組相比無統(tǒng)計學差異（P>0.05）。以上結果說明，TGF-β1能抑制原代肝細胞增殖，而熊果酸干預能明顯減弱TGF-β1對肝細胞

7、增殖的抑制作用，并促進肝細胞再生。
　　1.2熊果酸干預對TGF-β1誘導的肝細胞凋亡的影響
　　肝細胞經(jīng)TGF-β1作用12h后，其凋亡率比空白對照組顯著增加（P<0.01）；熊果酸對照組的肝細胞凋亡率要明顯低于空白對照組（P<0.01）；熊果酸干預組的肝細胞凋亡率較TGF-β1組明顯降低（P<0.01），與DPI干預組相比無統(tǒng)計學差異（P>0.05）。以上結果說明，TGF-β1誘導原代肝細胞凋亡，而熊果酸干預能明顯減少T

8、GF-β1誘導的肝細胞凋亡。
　　1.3熊果酸干預對TGF-β1誘導的肝細胞內CD95mRNA表達的影響
　　肝細胞經(jīng)TGF-β1作用6h后，細胞內CD95mRNA的表達比空白對照組顯著增加（P<0.01）；熊果酸對照組CD95mRNA的表達明顯低于空白對照組（P<0.01）；熊果酸干預組CD95mRNA水平較TGF-β1組顯著降低（P<0.01），與DPI干預組相比無統(tǒng)計學差異（P>0.05）。以上結果說明熊果酸干預能明顯

9、下調TGF-β1誘導的CD95mRNA的表達。
　　1.4熊果酸干預對TGF-β1誘導的肝細胞內CD95蛋白表達的影響
　　肝細胞經(jīng)TGF-β1作用12h后，細胞內CD95蛋白表達比空白對照組顯著增加（P<0.01）；熊果酸對照組CD95蛋白表達低于空白對照組（P<0.05）；熊果酸干預組CD95蛋白表達水平較TGF-β1組有所降低（P<0.05），與DPI干預組相比無統(tǒng)計學差異（P>0.05）。以上結果說明熊果酸干預能下調

10、TGF-β1誘導的CD95蛋白的表達。
　　2.熊果酸干預對TGF-β1誘導的肝細胞內NOX亞基p47phox膜移位的影響
　　肝細胞經(jīng)TGF-β1作用30min后，其p47phox亞基的膜移位比空白對照組顯著增加（P<0.01）；熊果酸對照組p47phox亞基膜移位明顯低于空白對照組（P<0.05）；熊果酸干預組p47phox亞基膜移位較TGF-β1組顯著降低（P<0.01），與DPI干預組相比無統(tǒng)計學差異（P>0.05）

11、。以上結果說明熊果酸干預能抑制TGF-β1誘導的p47phox亞基向膜移位，從而抑制肝細胞內NOX活性。
　　3.熊果酸干預對TGF-β1誘導的肝細胞內ROS生成的影響
　　肝細胞經(jīng)TGF-β1作用1h后，其DCF熒光強度比空白對照組明顯增加（P<0.01），與Rosup陽性對照組相比無顯著性差異（P>0.05）；熊果酸對照組熒光強度明顯低于空白對照組（P<0.05）；熊果酸干預組熒光強度較TGF-β1組顯著降低（P<0.0