1、綠色熒光蛋白(GFP)源于多管水母等海洋無脊椎動(dòng)物，是一種在生物化學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)中得到廣泛應(yīng)用，具有熒光特性的監(jiān)測(cè)細(xì)胞或組織內(nèi)基因表達(dá)和蛋白質(zhì)定位的標(biāo)記物。但為滿足日益提高的技術(shù)要求，大量性質(zhì)優(yōu)良的熒光蛋白突變體的應(yīng)用需求變得迫切起來。通過微流體芯片技術(shù)與合成生物學(xué)方法合成新型熒光蛋白基因，篩選獲得5個(gè)新型熒光蛋白，對(duì)其中一個(gè)紅色熒光蛋白(H10)和一個(gè)綠色熒光蛋白(G2)的性質(zhì)進(jìn)行了鑒定。設(shè)計(jì)多組實(shí)驗(yàn)對(duì)新型熒光蛋白的在活體菌株的生長速

2、率、熒光蛋白成熟時(shí)間、熒光蛋白表達(dá)速度、熒光蛋白光譜學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究，并通過Ni-IDA和FPLC層析兩步純化獲得高純度的熒光蛋白，質(zhì)譜分析熒光蛋白的分子量。以FLAG標(biāo)簽的原始序列DYKDDDDK
　　 (FLAG4)為模板，設(shè)計(jì)4種新FLAG標(biāo)簽FLAG1(DYKDYKYK),FLAG2(DYKGGGYK)．FLAG3(DYKDYKDYK)和FLAG5(DYKDEDDK)與G2、H10融合，通過PCR反應(yīng)分別將以上五種FLAG

3、標(biāo)簽融合到熒光蛋白基因的C端，得到重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a-FP-FLAG。在大腸桿菌BL21(DE3)細(xì)胞中表達(dá)重組蛋白，純化獲得高純度的融合蛋白，Western blotting分析篩選單克隆抗FLAG M2抗體(AFM2)特異性識(shí)別的融合蛋白，采用非競爭性ELISA固相法，經(jīng)確定最佳抗原包板濃度、最佳抗原包板時(shí)間及最佳抗原與抗體結(jié)合反應(yīng)時(shí)間后，得到了FP-FLAG與AFM2的抗原抗體結(jié)合反應(yīng)曲線，計(jì)算出FP-FLAG與AFM2的親

4、和常數(shù)。
　　 結(jié)果：顯示新型熒光蛋白G2,H10分子量分別28.187kD，27.091kD，不僅能夠正常的發(fā)揮熒光蛋白的生物學(xué)功能，且具有成熟速率更快、發(fā)光強(qiáng)度更強(qiáng)和發(fā)射波長更長的優(yōu)點(diǎn)。PCR擴(kuò)增、雙酶切及DNA測(cè)序鑒定表明重組質(zhì)粒pET28a-FP-FLAG.構(gòu)建正確。SDS-PAGE分析顯示在30kDa左右的位置有一條特異性蛋白條帶，與預(yù)期值相符，該系列重組蛋白以可溶性形式存在于菌體裂解液上清中。Western blot

5、ting分析表明單克隆抗FLAG M2抗體(AFM2)能夠特異性識(shí)別G2-FLAG4、G2-FLAG5、H10-FLAG3、H10-FLAG4、H10-FLAG5五種FP-FLAG融合蛋白。AFM2與G2-FLAG4、G2-FLAG5的親和常數(shù)分別為1.67E+11、4.65E+10,AFM2與H10-FLAG3、H10-FLAG4、H10-FLAG5的親和常數(shù)分別為6.49E+10、1.47E+11、6.63E+10。結(jié)果表明FLAG

6、原始序列FLAG4(DYKDDDDK)與AFM2之間的親和力最高，F(xiàn)LAG5(DYKDEDDK)與FLAG3(DYKDYKDYK)次之，F(xiàn)LAG1(DYKDYKYK)和FLAG2(DYKGGGYK)最弱。
　　 利用合成生物學(xué)和微流體芯片技術(shù)合成的新型熒光蛋白，不僅正常的發(fā)揮熒光蛋白的生物學(xué)功能，且具有成熟速率更快、發(fā)光強(qiáng)度更強(qiáng)和發(fā)射波長更長的優(yōu)點(diǎn)。其本身作為一種標(biāo)記物，與重組FLAG標(biāo)簽融合，形成一個(gè)既具有FLAG標(biāo)簽功能又含