1、背景：下腰痛是一個重要的公共衛(wèi)生問題，它是導致45歲以下人群勞動能力受限的最主要原因。流行病學調查顯示，全世界約70％的成年人口在一生中至少經歷過一次下腰痛。在美國下腰痛每年造成的經濟損失約900億美元，中國衛(wèi)生統(tǒng)計年鑒顯示2008年我國下腰痛位于所有慢性病患病率的第六位，可見在我國下腰痛造成的社會生產力損失同樣十分巨大。雖然目前下腰痛的確切病因尚未完全闡明，但椎間盤退變無疑是一個重要的誘因。椎間盤內的髓核細胞通過分泌細胞外基質維持椎間

2、盤功能，其數(shù)量減少和隨之帶來的細胞外基質代謝失衡是椎間盤退變重要的病理生理變化。近年來，細胞移植治療椎間盤退變方興未艾，間充質干細胞具有向髓核樣表型分化的能力，在椎間盤退變的生物學修復領域具有廣闊的應用前景。然而，由于椎間盤為乏血供組織，其能量代謝主要依靠糖酵解，導致其內部產生酸性、高滲、低氧和炎癥因子蓄積的惡劣微環(huán)境，在椎間盤退變過程中上述微環(huán)境進一步惡化，使得間充質干細胞的代謝活力和生物學修復能力受到損害，而上述微環(huán)境因素中又以酸性

3、微環(huán)境對間充質干細胞損害作用最為明顯。有研究表明，人類椎間盤內的pH值隨椎間盤退變程度的加重而下降。人類脂肪間充質干細胞具有獲取方便、供體部位損傷小、來源豐富和增殖能力強等優(yōu)勢，是一種理想的椎間盤組織工程種子細胞。人類脂肪間充質干細胞的供體年齡可能是細胞活力的一個重要影響因素，退變椎間盤不同程度的酸性微環(huán)境對人類脂肪間充質干細胞生物學活力的損害程度也很可能存在差異。然而，不同年齡來源的人類脂肪間充質干細胞對退變椎間盤不同程度酸性微環(huán)境的

4、耐受情況目前尚不清楚，闡明退變椎間盤不同程度酸性微環(huán)境對不同年齡組供體來源的人類脂肪間充質干細胞存活、增殖和細胞外基質代謝等生物學行為的影響，將為椎間盤生物學修復研究的種子細胞選擇提供重要參考。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，脂肪間充質干細胞對退變椎間盤存在一定的修復作用，但僅僅通過細胞移植、生長因子及抗炎藥物注射等手段很難確保脂肪間充質干細胞植入后在退變椎間盤惡劣的微環(huán)境中長期保持生物學活力并發(fā)揮修復作用。近年來有學者在椎間盤內發(fā)現(xiàn)了間充質干細

5、胞存在的證據(jù)，進一步的研究證實在人類退變髓核和終板中存在間充質干細胞，在人類纖維環(huán)中存在具有多向分化潛能的祖細胞;同時，動物的體內研究也證實髓核中存在間充質干細胞，并且發(fā)現(xiàn)這些內源性間充質干細胞在椎間盤內存在一定的遷移和修復行為，提示這種新型組織特異性間充質干細胞具有潛在的研究和應用價值。目前，髓核間充質干細胞的存在已經被多項研究所證實。本課題組在前期工作中成功分離培養(yǎng)出大鼠髓核間充質干細胞，它具有間充質干細胞的一般特性，能夠實現(xiàn)成軟骨

6、、成脂和成骨分化，完全符合國際細胞治療協(xié)會關于間充質干細胞的認定標準。然而，作為一種新型組織特異性間充質干細胞，髓核間充質干細胞是否能夠成為一種更加合適的椎間盤組織工程種子細胞這個問題尚不得而知。比較退變椎間盤酸性微環(huán)境對髓核間充質干細胞和脂肪間充質干細胞的存活、增殖和細胞外基質代謝等重要生物學行為的影響，將有助于我們更好的理解這兩種間充質干細胞的生物學特性，并對其在椎間盤生物學修復領域的應用前景做出正確的評價，從而為下一步開發(fā)具有潛在

7、應用價值的椎間盤干細胞修復技術提供實驗依據(jù)。本研究分為兩個部分：
　　第一部分：退變椎間盤酸性微環(huán)境對人類脂肪間充質干細胞生物學行為的影響。
　　目的：研究退變椎間盤酸性微環(huán)境對不同年齡組供體來源的人類脂肪間充質干細胞的存活、增殖以及細胞外基質代謝等生物學行為的影響，探索適合進行脂肪間充質干細胞移植干預的椎間盤微環(huán)境pH閾值，明確供體年齡對人類脂肪間充質干細胞酸性微環(huán)境適應能力的影響。
　　方法：人類脂肪間充質干細胞根

8、據(jù)供體來源分為未成年組（8-12歲，n=6）和成年組（33-42歲，n=6）。設立pH值7.4的培養(yǎng)條件作為標準培養(yǎng)條件，使用pH值為7.1，6.8和6.5的培養(yǎng)條件分別模擬正常椎間盤、輕度退變椎間盤和嚴重退變椎間盤的酸性微環(huán)境特征。采用異硫氰酸熒光素橋連膜聯(lián)蛋白-Ⅴ/碘化丙啶染色(Fluorescein isothiocyanate-Annexin-Ⅴ/propidium iodide staining, FITC-AⅤ/PI)測定細

9、胞存活。采用MTT(3-[4，5-dimethylthiazol-2-yl]-2，5-diphenyl tetrazolium bromide，3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑澳鹽）法測定細胞增殖。使用實時定量聚合酶鏈反應(Real-Time PCR)檢測聚集蛋白聚糖(Aggrecan)、Ⅰ型膠原(Collagen-Ⅰ)、Ⅱ型膠原(Collagen-Ⅱ)、基質金屬蛋白酶2(Matrix metalloproteina

10、se-2，MMP-2)、金屬蛋白酶組織抑制3（Tissue inhibitor of metalloproteinase-3，TIMP-3），p53和細胞凋亡蛋白酶3(Caspase-3)的mRNA表達水平，使用酶聯(lián)免疫吸附測定法（Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）測定聚集蛋白聚糖、Ⅰ型膠原、Ⅱ型膠原、MMP-2和TIMP-3的蛋白表達水平。
　　結果：退變椎間盤酸性微環(huán)境能夠降低未

11、成年組和成年組供體來源的人類脂肪間充質干細胞的存活和增殖能力，并且抑制它們的聚集蛋白聚糖、Ⅰ型膠原和Ⅱ型膠原的基因和蛋白表達水平。未成年組和成年組供體來源的人類脂肪間充質干細胞對退變椎間盤酸性微環(huán)境的應答模式相似，但是未成年組供體來源的人類脂肪間充質干細胞對退變椎間盤酸性微環(huán)境的耐受能力強于成年組供體來源的人類脂肪間充質干細胞。
　　結論：本研究顯示退變椎間盤酸性微環(huán)境是人類脂肪間充質干細胞用于椎間盤生物學修復的重要有害因素，來源

12、于未成年組供體的人類脂肪間充質干細胞可能更加適合用于椎間盤生物學修復，人類脂肪間充質干細胞用于椎間盤生物學修復可能在退變早期（當退變椎間盤病理組織微環(huán)境pH值大于6.8時）更加有效。
　　第二部分：退變椎間盤酸性微環(huán)境對大鼠髓核間充質干細胞和脂肪間充質干細胞生物學行為的影響。
　　目的：研究退變椎間盤酸性微環(huán)境對大鼠髓核間充質干細胞和脂肪間充質干細胞的存活、增殖以及細胞外基質代謝等生物學行為的影響。
　　方法：從健康雄

13、性大鼠身上提取的髓核間充質干細胞和脂肪間充質干細胞分別在四種不同的pH條件下進行培養(yǎng)，分別是標準條件(pH7.4)和模擬正常、輕度退變和重度退變的椎間盤微環(huán)境（pH值分別為7.1，6.8和6.5）;采用異硫氰酸熒光素橋連膜聯(lián)蛋白-Ⅴ/碘化丙啶染色(Fluorescein isothiocyanate-Annexin-Ⅴ/propidium iodide staining，F(xiàn)ITC-AⅤ/PI)評價細胞存活，CCK-8（Cell coun

14、ting kit-8）測定細胞增殖，實時定量聚合酶鏈反應(Real-Time PCR)和蛋白印跡法(Westernblot)檢測聚集蛋白聚糖(Aggrecan)、Ⅰ型膠原(Collagen-Ⅰ)、Ⅱ型膠原(Collagen-Ⅱ)、基質金屬蛋白酶2(Matrix metalloproteinase-2，MMP-2)、Ⅳ型血小板結合蛋白基序的解聚蛋白樣金屬蛋白酶(A disintegrin and metalloproteinase wit

15、hthrombospondin motifs4，ADAMTS4)和金屬蛋白酶組織抑制劑3(Tissue inhibitor ofmetalloproteinase-3，TIMP-3)的基因和蛋白表達水平。
　　結果：退變椎間盤酸性微環(huán)境能夠顯著抑制大鼠髓核間充質干細胞和脂肪間充質干細胞的存活與增殖;同時，該酸性微環(huán)境能夠抑制上述兩種間充質干細胞中聚集蛋白聚糖、Ⅰ型膠原、Ⅱ型膠原以及TIMP-3的基因和蛋白表達水平，并且提高MMP-

16、2和ADAMTS4的基因和蛋白表達水平。但是，與脂肪間充質干細胞相比，該酸性微環(huán)境對髓核間充質干細胞的存活與增殖能力的抑制作用明顯較弱，同時髓核間充質干細胞具有更高的聚集蛋白聚糖、Ⅱ型膠原和TIMP-3表達水平，以及更低的MMP-2和ADAMTS4表達水平。
　　結論：退變椎間盤的酸性微環(huán)境是髓核間充質干細胞和脂肪間充質干細胞修復椎間盤的主要障礙之一;髓核間充質干細胞較脂肪間充質干細胞更能耐受該酸性微環(huán)境，因而可能成為一種新型種子