1、姜黃素對(duì)自發(fā)性卒中型高血壓大鼠腦卒中預(yù)防作用及機(jī)制。
　　腦卒中是引起人類致死和致殘的主要原因之一，給個(gè)人、家庭、社會(huì)帶來(lái)沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，嚴(yán)重影響個(gè)人的生活質(zhì)量。因此通過(guò)對(duì)高危人群實(shí)施卒中預(yù)防，消除或減少影響高危人群健康的危險(xiǎn)因素，顯得尤為重要。近年來(lái)可食用類植物對(duì)卒中的預(yù)防作用由于其依從性好而且副作用少，因此越來(lái)越受到人們的重視。
　　姜黃素（Curcumin）是一種植物多酚，其具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，包括:抗癌、抗氧化、抗

2、炎癥因子、抗血小板聚集、降脂等作用。姜黃素通可過(guò)上調(diào)內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)的表達(dá)或磷酸化，提高內(nèi)源性一氧化氮的生成，從而改善內(nèi)皮功能。因此姜黃素的這些特性為其預(yù)防腦卒中提供了理論基礎(chǔ)。
　　在我們前期的預(yù)實(shí)驗(yàn)中，與對(duì)照組相比，給予姜黃素組大鼠的卒中發(fā)生時(shí)間明顯延遲，生存時(shí)間明顯延長(zhǎng)，而且這種預(yù)防效應(yīng)并非依賴血壓的降低所致。因此姜黃素對(duì)腦卒中的預(yù)防作用機(jī)制尚不清楚。既往研究表明，血管內(nèi)皮功能在心腦血管疾病的發(fā)生、發(fā)展中起到了

3、至關(guān)重要的作用。內(nèi)皮細(xì)胞的損傷和功能紊亂是動(dòng)脈血管功能障礙的始動(dòng)因素。血管內(nèi)皮功能障礙主要表現(xiàn)為血管內(nèi)皮依賴性舒張功能的受損，血管舒張功能的受損明顯增加心腦血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)。內(nèi)皮源性的一氧化氮是一增加腦血流、保護(hù)腦血管的重要內(nèi)源性物質(zhì)，增加內(nèi)皮細(xì)胞的一氧化氮的生成可以保護(hù)腦缺血區(qū)及縮小梗死面積。因此我們推測(cè)姜黃素可能參與降低氧化應(yīng)激水平，保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞，提高內(nèi)皮細(xì)胞的一氧化氮的產(chǎn)量或活性，改善血管舒張功能有關(guān)。
　　解偶聯(lián)蛋白2(

4、UCP2)是位于線粒體內(nèi)膜上解偶聯(lián)蛋白家族中一員，其主要功能是參與質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)使氧化磷酸化脫偶聯(lián)，同時(shí)也通過(guò)介導(dǎo)“質(zhì)子漏”，負(fù)性調(diào)控活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)的產(chǎn)生，從而減輕氧化應(yīng)激(oxidative stress)反應(yīng)。UCP2基因敲除小鼠出現(xiàn)動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓、血管舒張功能降低，而過(guò)表達(dá)UCP2后能減少因NF-kB激活而導(dǎo)致的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，改善血管功能。因此我們推測(cè)姜黃素有可能通過(guò)上調(diào)UCP2

5、蛋白的表達(dá)來(lái)保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞，改善血管舒張功能，起到預(yù)防腦卒中的作用。
　　為證實(shí)上述假設(shè)，我們以自發(fā)性卒中型高血壓大鼠及臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞為研究對(duì)象，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)相結(jié)合，主要研究:(1)姜黃素對(duì)大鼠卒中發(fā)生時(shí)間和生存率影響。(2)姜黃素抗氧化應(yīng)激和改善血管功能的作用。(3)UCP2在姜黃素抗氧化、調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞自噬和凋亡中的作用。
　　1.姜黃素對(duì)自發(fā)性卒中型高血壓大鼠腦卒中的預(yù)防作用
　　1.1方法：
　　1.1.1姜黃

6、素對(duì)卒中型高血壓大鼠血壓、體重、生存率及卒中發(fā)生時(shí)間的影響
　　1.1.2姜黃素對(duì)頸內(nèi)動(dòng)脈血管功能的影響
　　1.1.3觀察姜黃素對(duì)椎基底動(dòng)脈及內(nèi)皮細(xì)胞中的一氧化氮(NO)，氧化應(yīng)激產(chǎn)物的影響
　　1.1.4姜黃素對(duì)頸動(dòng)脈及內(nèi)皮細(xì)胞解偶聯(lián)蛋白2表達(dá)的影響
　　1.1.5姜黃素對(duì)自噬和凋亡的影響
　　1.2結(jié)果：
　　1.2.1姜黃素對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠的體重、血壓及腦組織/體重比無(wú)明顯影響。
　　與對(duì)照組

7、相比，姜黃素飼養(yǎng)組大鼠的血壓有下降趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，2組大鼠質(zhì)量及腦組織質(zhì)量/大鼠質(zhì)量之比也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　1.2.2姜黃素延遲了卒中型高血壓大鼠卒中發(fā)生時(shí)間及提高了大鼠的生存率
　　與對(duì)照組相比，姜黃素飼養(yǎng)組大鼠卒中發(fā)生時(shí)間明顯延遲，生存率明顯提高，對(duì)照組大鼠在實(shí)驗(yàn)開始第2周時(shí)出現(xiàn)卒中，在6-8周達(dá)高峰，第3周開始死亡，在7-10周死亡達(dá)高峰期，而姜黃素組大鼠在第3周開始出現(xiàn)卒中現(xiàn)象，在8-10周達(dá)高峰，第3周開始

8、死亡，10-15周死亡達(dá)高峰期。
　　1.2.3姜黃素明顯改善卒中型高血壓大鼠頸動(dòng)脈血管舒張功能
　　在本部分實(shí)驗(yàn)中，我們檢測(cè)了姜黃素飼養(yǎng)組與對(duì)照組大鼠的頸動(dòng)脈舒張功能，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組大鼠頸動(dòng)脈血管無(wú)論是對(duì)乙酰膽堿（內(nèi)皮依賴性）或硝普鈉（非內(nèi)皮依賴性）的舒張血管的反應(yīng)均明顯強(qiáng)于對(duì)照組，提示姜黃素具有改善血管舒張功能的作用。同時(shí)我們也檢測(cè)了血管對(duì)苯腎上腺素的收縮反應(yīng)，結(jié)果提示兩組大鼠頸動(dòng)脈血管收縮反應(yīng)并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

9、　　1.2.4姜黃素增加卒中型高血壓大鼠的頸動(dòng)脈組織及血液中的一氧化氮含量，降低了氧化應(yīng)激產(chǎn)物，增強(qiáng)了抗氧化能力。
　　在本實(shí)驗(yàn)中我們檢測(cè)了卒中型高血壓大鼠頸動(dòng)脈組織一氧化氮、活性氧簇的含量，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組頸動(dòng)脈一氧化氮含量明顯增加，而活性氧簇(ROS)顯著減少，同時(shí)我們也檢測(cè)了血漿中的一氧化氮(NO)、氧化應(yīng)激標(biāo)志物（丙二醛，MDA）、超氧化物歧化酶(SOD)的含量。與對(duì)照組相比，姜黃素組大鼠一氧化氮及超氧化物歧化酶含量明

10、顯提高，而氧化應(yīng)激產(chǎn)物顯著減少。結(jié)果提示:姜黃素有明顯的抗氧化能力和增加一氧化氮作用。
　　1.3結(jié)論：
　　1.3.1.姜黃素延遲了卒中型高血壓大鼠卒中發(fā)生時(shí)間并且提高了生存率
　　1.3.2.姜黃素改善了卒中型高血壓大鼠的血管舒張功能
　　1.3.3.姜黃素可能同過(guò)上調(diào)解偶聯(lián)蛋白2(UCP2)來(lái)發(fā)揮抗氧化，增加細(xì)胞自噬、減少細(xì)胞凋亡來(lái)保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞，進(jìn)而增加血管內(nèi)皮細(xì)胞一氧化氮生成，改善血管舒張功能，從而達(dá)到預(yù)

11、防卒中的作用。
　　2.腎近曲小管細(xì)胞多巴胺D3受體對(duì)多巴胺D4受體影響的機(jī)制研究
　　腎臟近曲小管通過(guò)對(duì)水鈉調(diào)節(jié)而在人體血壓調(diào)控中發(fā)揮重要的作用，在腎臟中，70％的超濾液及全部的氨基酸及葡萄糖通過(guò)腎近曲小管重吸收，而在這一調(diào)控中，腎臟多巴胺受體起到了重要作用。腎臟多巴安受體按其藥理特性及結(jié)構(gòu)分D1類受體(D1、D5受體)及D2類受體（D2、D3、D4受體），所有多巴胺受體直接或間接的參與了對(duì)腎臟水鈉及血壓的調(diào)節(jié)。同為D2類

12、受體的腎臟多巴胺D3、 D4受體在腎近曲小管表達(dá)豐富。刺激D3受體腎臟尿鈉排泄增加，多巴胺D3受體基因敲除小鼠腎臟尿鈉排泄下降，血壓升高。D4受體基因敲除小鼠收縮壓及舒張壓均明顯高于正常小鼠，在腎臟近曲小管，刺激D4受體，鈉-鉀-ATP酶(Na+-K+-ATPase)活性明顯下降。
　　2.1方法：
　　2.1.1放線菌素(cycloheximide，CHX))預(yù)處理細(xì)胞后，免疫印跡法檢測(cè)D4受體蛋白的表達(dá)。
　　2.

13、1.2激光共聚焦檢測(cè)D3受體及D4受體在腎小管上皮細(xì)胞膜轉(zhuǎn)位，激光共聚焦和免疫共沉淀方法檢測(cè)D3受體及D4受體在腎小管上皮細(xì)胞的共存和物理連接。
　　2.1.3不同信號(hào)分子的阻斷劑預(yù)先處理腎小管上皮細(xì)胞后，D3受體激動(dòng)劑PD128907孵育腎小管上皮細(xì)胞24小時(shí)，免疫印跡法檢測(cè)D4受體蛋白表達(dá)。
　　2.2結(jié)果：
　　2.2.1 D3受體激動(dòng)劑抑制WKY腎近曲小管細(xì)胞D4受體蛋白降解
　　在我們的前期實(shí)驗(yàn)中，我們

14、發(fā)現(xiàn)D3受體激動(dòng)劑PD128907增加WKY細(xì)胞D4受體mRNA和蛋白的表達(dá)，降低了SHR細(xì)胞D4受體mRNA和蛋白的表達(dá)，為進(jìn)一步明確這效應(yīng)的內(nèi)在機(jī)制，我們?cè)诮o予RPT細(xì)胞放線菌素(cycloheximide，CHX))預(yù)處理，再給予PD128907處理細(xì)胞后檢測(cè)D4受體表達(dá)，結(jié)果表明:WKY細(xì)胞D4受體蛋白降解速度下降，而SHR細(xì)胞無(wú)明顯影響。提示:蛋白翻譯后降解參與了這一效應(yīng)。
　　2.2.2 PD128907增加D4受體對(duì)

15、鈉-鉀-ATP酶的抑制作用非受體膜轉(zhuǎn)位依賴性。
　　在我們的前期實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)D3受體激動(dòng)劑PD128907增加WKY細(xì)胞D4受體對(duì)鈉-鉀-ATP酶的抑制作用，而對(duì)SHR細(xì)胞無(wú)明顯影響，我們進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn):PD128907刺激WKY和SHR細(xì)胞后，胞內(nèi)D3受體和D4受體膜轉(zhuǎn)位并無(wú)明顯區(qū)別，提示:PD128907增加D4受體對(duì)鈉-鉀-ATP酶的抑制作用非受體膜轉(zhuǎn)位依賴性。
　　2.2.3 D3受體及D4受體在腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)

16、存在共存和物理連接現(xiàn)象
　　在這部分實(shí)驗(yàn)中，我們采用激光共聚焦和免疫共沉淀方法觀察了多巴胺D3受體和D4受體在腎近曲小管是否存在共存現(xiàn)象和直接作用，結(jié)果提示:D3受體和D4受體在腎近曲小管細(xì)胞內(nèi)表達(dá)豐富且存在共存現(xiàn)象，D3受體激動(dòng)劑PD128907處理WKY(正常大鼠)細(xì)胞后，D3受體和D4受體的物理連接加強(qiáng)，這一作用在SHR（原發(fā)性高血壓大鼠）腎近曲小管細(xì)胞內(nèi)消失。
　　2.2.4 D3受體對(duì)D4受體的功能影響通過(guò)PLC/