1、食管癌在我國乃至世界范圍內(nèi)都是發(fā)病率和死亡率較高的惡性腫瘤之一，其病理組織學(xué)分類多樣，例如鱗狀細胞癌、腺癌、未分化癌等，但以下面兩種最為多見:食管腺癌、食管鱗狀細胞癌。食管癌在我國本身就高發(fā)，再加上我國人口基數(shù)大，每年新發(fā)病例便多，約占全世界新發(fā)病例的半數(shù)左右，而且可能由于遺傳、飲食習(xí)慣等原因病理組織學(xué)類型分布與歐美不同，其中食管鱗狀細胞癌占絕對多數(shù)，約占食管癌的90％，造成了極大的經(jīng)濟負擔(dān)和社會負擔(dān)。隨著內(nèi)鏡技術(shù)的發(fā)展，有不少食管鱗狀

2、細胞癌能夠在非常早期便被發(fā)現(xiàn)，從而通過內(nèi)鏡下食管粘膜剝離術(shù)治療，另外胸中段食管癌占據(jù)多數(shù)，分期稍晚的但是有外科手術(shù)機會的患者多以進行食管癌根治術(shù)+胸腹兩野淋巴結(jié)清掃術(shù)為主，但內(nèi)鏡下食管粘膜剝離術(shù)無法對淋巴結(jié)進行清掃，而食管癌根治術(shù)+胸腹兩野淋巴結(jié)清掃術(shù)無法對可能隱匿的頸部淋巴結(jié)進行清掃，術(shù)后容易轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，還有很多患者發(fā)現(xiàn)時便已錯過手術(shù)機會，總體5年生存率很低。近些年來，隨著科技和社會的進步，分子靶向治療越來越顯示出優(yōu)勢，在一些惡性腫瘤

3、的治療方面起到了很好的作用。例如應(yīng)用索拉菲尼對肝癌進行治療和應(yīng)用易瑞沙對肺癌進行治療，極大的改善了腫瘤患者的預(yù)后。與食管鱗狀細胞癌相關(guān)的基因及其產(chǎn)物，在近些年研究的也比較多，但到目前為止，仍然沒有能得到臨床公認并廣泛應(yīng)用的指標。鑒于以上幾點原因，我們認為繼續(xù)尋找在食管鱗狀細胞癌發(fā)生及進展過程中有重要作用的因子，并研究其作用機制，可能帶來兩方面益處:一是如果能夠提示某些患者預(yù)后差的話可以制定個體化治療，例如術(shù)后聯(lián)合放療，另外如果某些基因及

4、產(chǎn)物對癌細胞的擴散有幫助的話可以針對其研究藥物進行精準治療。
　　高遷移率族蛋白A2，簡稱HMGA2，是一種非組蛋白染色體蛋白，能夠通過改變脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)的結(jié)構(gòu)來調(diào)節(jié)某些基因的轉(zhuǎn)錄與表達，作用方式是通過AT-hook結(jié)構(gòu)域與DNA結(jié)合，因此又被稱為“構(gòu)筑轉(zhuǎn)錄因子”。研究發(fā)現(xiàn)HMGA2與機體的生長發(fā)育密切相關(guān)，在胚胎早期高表達，而在正常成人分化成熟的組織中幾乎檢測不出。近年來，多項

5、研究發(fā)現(xiàn)在一些良惡性腫瘤中存在HMGA2的異常表達，并且HMGA2表達增高往往預(yù)示著該腫瘤容易轉(zhuǎn)移和浸潤，預(yù)后差。隨之進一步的細胞學(xué)研究發(fā)現(xiàn)抑制HMGA2的表達后腫瘤細胞的增殖速度減慢，侵襲能力減弱。以上這些研究提示HMGA2可能在腫瘤的發(fā)生及進展過程中發(fā)揮一定的作用。
　　食管鱗狀細胞癌做為一種常見惡性腫瘤，HMGA2的表達如何，抑制HMGA2表達后食管鱗狀細胞癌癌細胞的增殖速度及侵襲能力會有怎樣的變化，目前尚沒有系統(tǒng)的研究報道

6、。所以我們設(shè)計了此項研究，首先對食管鱗狀細胞癌及癌旁組織中HMGA2的表達情況進行檢測，方法包括Western Blot及免疫組織化學(xué)法，其次將癌組織中HMGA2檢測結(jié)果結(jié)合患者的臨床病理資料及隨訪資料進行分析，尋找與食管鱗狀細胞癌患者預(yù)后相關(guān)的因素，然后通過慢病毒轉(zhuǎn)染及RNA干擾的方法抑制HMGA2的異常表達，將HMGA2受到抑制的細胞進行CCK-8法細胞增殖實驗及transwell實驗，從而研究HMGA2對食管鱗狀細胞癌細胞的增殖及

7、侵襲能力的影響，以期為食管鱗狀細胞癌的分子靶向治療提供一個可供選擇的靶點。
　　第一部分 食管鱗狀細胞癌組織中HMGA2的表達檢測及其與患者臨床和病理特點之間的相關(guān)性研究
　　目的:
　　檢測食管鱗狀細胞癌患者的癌組織中是否有HMGA2的異常表達，及HMGA2異常表達與患者臨床特點和病理特點之間的相關(guān)性。
　　方法:
　　在這部分實驗中，我們根據(jù)入選標準對自2007年10月至2009年9月在山東省立醫(yī)院胸外

8、科住院并接受經(jīng)右胸上腹二切口食管癌切除+胃食管右胸頂吻合術(shù)(Ivor-Lewis)的胸中段食管鱗狀細胞癌患者進行篩選，最終有127例患者達到標準成為研究對象，對以上患者的術(shù)后標本進行收集，每位患者留取的標本均包括食管鱗狀細胞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)組織及相應(yīng)的健康食管粘膜（corresponding healthy esophageal mucosa，CHEM）組織，對兩組標本

9、進行HMGA2表達情況檢測，方法包括蛋白質(zhì)免疫印跡(WB)和免疫組織化學(xué)(IHC)方法，將檢測結(jié)果進行比較。再通過統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS19.0將食管鱗狀細胞癌組織中HMGA2表達情況與患者的年齡、性別、腫瘤長度、T分期、組織分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況用卡方檢驗的方法進行相關(guān)性分析。P＜0.05時認為有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　結(jié)果:
　　進行免疫組織化學(xué)法檢測時，從顯微鏡下觀察，當細胞核內(nèi)出現(xiàn)黃色或棕色顆粒認為有HMGA2表

10、達。免疫組化評分≥4的樣本認為有HMGA2陽性表達。檢測結(jié)果顯示HMGA2陽性表達率在食管鱗狀細胞癌組織中是63.3％(72/127)，在相應(yīng)的健康食管粘膜組織中無陽性表達，兩組相比有顯著差異?？ǚ綑z驗相關(guān)性分析顯示與HMGA2陽性表達有相關(guān)性的臨床及病理特點包括:組織分化程度(P=0.008)，T分期（代表浸潤深度）(P=0.007)，是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P＜0.001)、TNM分期(P=0.006);無相關(guān)性的臨床及病理特點包括:性別

11、(P=0.291)、年齡(P=0.857)及病變長度(P=0.854)。迸一步的蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測顯示HMGA2的陽性表達率在Ⅲ期和Ⅳ期患者癌組織中顯著高于Ⅰ期和Ⅱ期患者癌組織。
　　結(jié)論:
　　食管鱗狀細胞癌中有HMGA2的高表達，且與HMGA2表達增高相關(guān)的臨床及病理特點包括:組織分化程度、是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期及T分期（代表浸潤深度），HMGA2可能與食管鱗狀細胞癌的浸潤能力及臨床進展相關(guān)。
　　第二部分

12、 影響食管鱗狀細胞癌患者預(yù)后的相關(guān)因素分析
　　目的:
　　研究影響食管鱗狀細胞癌患者預(yù)后的相關(guān)因素中是否包括HMGA2的表達。
　　方法:
　　本部分實驗中，研究對象仍為2007年10月至2009年9月在山東省立醫(yī)院胸外科住院并接受經(jīng)右胸上腹二切口食管癌切除+胃食管右胸頂吻合術(shù)(Ivor-Lewis)的胸中段食管鱗狀細胞癌患者，通過對患者術(shù)后進行定期的隨訪觀察，記錄生存時間。統(tǒng)計軟件采用SPSS19.0，統(tǒng)計方

13、法包括應(yīng)用Kaplan-Meier生存曲線繪制總體的生存曲線及HMGA2不同表達組的生存曲線，將收集的臨床資料、病理特點以及HMGA2表達情況均進行Log-rank檢驗篩選出與生存時間相關(guān)的因素，再通過Cox回歸分析最終篩選出影響患者生存時間的獨立危險因素。P值＜0.05時認為有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　結(jié)果顯示總體5年生存率是19.69％。HMGA2表達陽性組和HMGA2表達陰性組5年生存率差異顯著(13.89％vs.

14、27.27％，P＜0.001)。通過Log-rank檢驗得出與生存時間相關(guān)的因素還包括:TNM分期、是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及組織分化程度。將以上四項進行Cox回歸多因素分析后顯示影響食管鱗狀細胞癌患者預(yù)后的獨立危險因素包括:腫瘤TNM分期(P=0.006)，組織學(xué)分化程度(P=0.003)和HMGA2表達水平(P=0.048)。
　　結(jié)論:
　　影響食管鱗狀細胞癌患者術(shù)后5年生存率的獨立危險因素包括:腫瘤組織學(xué)分化程度、TNM分期

15、及HMGA2表達水平。
　　第三部分 應(yīng)用RNAi沉默技術(shù)觀察HMGA2基因?qū)κ彻荀[狀細胞癌Eca109細胞生物學(xué)行為的影響
　　目的:
　　應(yīng)用RNAi沉默技術(shù)研究HMGA2對食管鱗狀細胞癌細胞系Eca109細胞增殖速度和侵襲能力的影響。
　　方法:
　　在本部分的實驗研究中，首先對食管鱗狀細胞癌細胞系Eca109中HMGA2的表達情況進行檢測，方法包括定量即時聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)和蛋白質(zhì)免疫印

16、跡法，再通過攜帶HMGA2shRNA的慢病毒和攜帶NCshRNA的慢病毒分別轉(zhuǎn)染食管鱗狀細胞癌細胞系Eca109，從而將細胞系分為三組:HMGA2組、NC組、空白對照組，分別通過定量即時聚合酶鏈反應(yīng)和蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測三組中HMGA2mRNA和HMGA2蛋白，驗證HMGA2組細胞系中HMGA2的表達確實被抑制后進一步通過細胞功能學(xué)實驗CCK-8法和transwell法來觀察抑制HMGA2表達后食管鱗狀細胞癌細胞系Eca109細胞的增殖

17、速度和侵襲能力變化。
　　結(jié)果:
　　定量即時聚合酶鏈反應(yīng)和免疫組織化學(xué)法檢測結(jié)果均顯示HMGA2在食管鱗狀細胞癌細胞系Eca109中表達增高。應(yīng)用RNA干擾技術(shù)和慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)可以成功構(gòu)建HMGA2低表達的Eca109細胞系，而且該細胞系可以穩(wěn)定傳代，與其它兩組比較，CCK-8法實驗顯示HMGA2表達被抑制后癌細胞的增殖速度減慢，transwell實驗顯示HMGA2表達被抑制后癌細胞的侵襲能力減弱。
　　結(jié)論: