1、薏苡仁為禾本科薏苡（Coix lachryma-jobi L.var.ma-yuen(Roman)Stapf）的干燥成熟種仁，國內外研究發(fā)現薏苡仁中含有酯類、不飽和脂肪酸類、糖類及內酰胺類等活性成分，具有抗腫瘤、提高免疫力、降血糖等作用。作為薏苡仁的主要抗腫瘤活性成分，薏苡仁油已被臨床用于抗肝腫瘤治療；而薏苡仁中另一類抗腫瘤活性成分是薏苡仁多糖，在免疫功能的調節(jié)方面作用明確。但是，兩者的理化性質缺陷導致了其腸道吸收較差，目前以增強其口服

2、吸收為目的的口服新劑型研究尚處于起步階段。微乳作為新型的納米載體之一，是一種由油相、水相、表面活性劑和助表面活性劑按適當比例制得的一種透明、黏度低、且熱力學穩(wěn)定的溶液體系，其粒徑較小、穩(wěn)定性較好，能夠促進難溶性藥物的口服吸收。本課題組前期研究中以薏苡仁油為微乳油相，荷載靈芝三萜，制備了薏苡仁油-靈芝三萜組分微乳，有效地提高了薏苡仁油及靈芝三萜的體內吸收。然而，微乳遞送系統(tǒng)主要依靠EPR效應實現腫瘤部位的特異性聚集，為實現進一步提高對腫瘤

3、細胞的識別能力，表面修飾可腫瘤靶向的小分子配體是一種切實可行的辦法。本研究以薏苡仁中薏苡仁油及多糖兩種抗腫瘤活性組分，制備了薏苡仁組分微乳（Coix seed components-based microemulsions, C-MEs）；并且利用肝腫瘤細胞膜表面去唾液酸糖蛋白受體（ASGPR）能特異性識別具有半乳糖片段的小分子特點，設計合成了三種不同構象的疏水化半乳糖酯，并將其修飾于C-MEs表面得到半乳糖酯修飾的薏苡仁組分微乳（Ga

4、lactose ester-modified coix seed components-based microemulsions，Gal-C-MEs），以期待進一步提高薏苡仁組分微乳的肝腫瘤靶向和抗腫瘤作用。課題通過對所設計的微乳進行系統(tǒng)地藥劑學性質表征、細胞水平的靶向和抗腫瘤考察、體內水平的腫瘤分布和抗腫瘤評價，為探索有中醫(yī)藥特色的中藥多組分腫瘤靶向納米制劑提供理論依據和實踐探索。本文主要研究內容如下：
　　1.不同分子構象半乳

5、糖酯的合成及表征
　　分別以辛酸乙烯酯、丁酸乙烯酯及醋酸乙烯酯與半乳糖為原料，在Novozym435固定化脂肪酶的催化下合成辛酰半乳糖酯（ Gal(oct)）、丁酰半乳糖酯（Gal(but)）及乙酰半乳糖酯（Gal(ace)）。反應條件：辛酸乙烯酯、丁酸乙烯酯、
　　醋酸乙烯酯與半乳糖摩爾比均為1:1，60℃油浴，回流反應12-18 h，得粗產物，并以硅膠柱色譜，分別以石油醚-醋酸乙酯（8:1、12:1與15:1）為洗脫劑洗

6、脫，將所得產物經FT-IR與1H-NMR鑒定為辛酰半乳糖酯、丁酰半乳糖酯及乙酰半乳糖酯。由于乙酰半乳糖酯純化難度高、副產物多，因此選擇辛酰半乳糖酯與丁酰半乳糖酯用于后續(xù)實驗。
　　2.半乳糖酯修飾薏苡仁組分微乳的制備與表征
　　以薏苡仁油為油相，以薏苡仁多糖水溶液為水相，結合偽三元相圖，篩選出半乳糖酯修飾薏苡仁組分微乳處方，并對微乳的外觀形態(tài)、平均粒徑、zeta電位等理化參數進行表征，通過穩(wěn)定性對微乳進行質量評價。
　

7、?。?）半乳糖酯修飾薏苡仁組分微乳處方篩選：采用偽三元相圖法，篩選出半乳糖酯修飾薏苡仁組分微乳處方，并采用水滴定法制備微乳：稱取RH40150 mg，PEG40050 mg，半乳糖酯32 mg，磁力攪拌2 h，加入薏苡仁油200 mg，繼續(xù)磁力攪拌2 h，以2 mL薏苡仁多糖水溶液（120 mg/mL）為水相，水滴定法制備辛酰半乳糖酯修飾薏苡仁組分微乳與丁酰半乳糖酯修飾薏苡仁組分微乳（Gal(oct)-C-MEs）與（Gal(but)-

8、C-MEs）。
　?。?）Gal(oct)-C-MEs、Gal(but)-C-MEs理化性質表征及質量評價：采用動態(tài)光散射法及透射電鏡法對微乳的表面性質及形態(tài)學進行了表征，結果顯示兩種微乳外觀均澄清透明，Gal(oct)-C-MEs的粒徑、PDI及電位分別為64.32±5.63 nm、0.094±0.006、-0.715±0.230 mV；Gal(but)-C-MEs的粒徑、PDI及電位分別為59.68±6.65 nm、0.070

9、±0.006、-2.950±0.230 mV；透射電鏡觀察顯示所制備的Gal(oct)-C-MEs與Gal(but)-C-MEs外觀均圓整，分散也較均勻，且所構建的微乳在不同稀釋倍數、高速離心、放置時間、不同pH條件下均保持較強穩(wěn)定性。3.半乳糖酯修飾薏苡仁組分微乳的細胞水平評價
　　（1）Gal(oct)-C-MEs與Gal(but)-C-MEs對人肝癌HepG2細胞抗增殖作用
　　采用MTT法考察了Gal(oct)-C-

10、MEs與Gal(but)-C-MEs對人肝癌HepG2細胞生長抑制作用。結果顯示，在薏苡仁油濃度為7.81~250.00μg/mL時，C-MEs、Gal(but)-C-MEs、Gal(oct)-C-MEs對人HepG2細胞增殖均有明顯抑制作用，且與薏苡仁油濃度正相關。C-MEs、Gal(but)-C-MEs與Gal(oct)-C-MEs的IC50值分別為71.23±6.09、62.55±0.36、47.98±4.00μg/mL。Gal(

11、but)和Gal(oct)修飾使C-MEs的IC50分別降低了1.14倍和1.48倍。
　　（2）HepG2細胞對Gal(oct)-C-MEs與Gal(but)-C-MEs的攝取研究
　　采用倒置熒光顯微鏡及流式細胞儀考察了HepG2細胞對Gal(oct)-C-MEs與Gal(but)-C-MEs的攝取情況。實驗結果表明，C-MEs、Gal(oct)-C-MEs及Gal(but)-C-MEs組熒光強度顯著強于薏苡仁混合液組，

12、提示薏苡仁組分形成微乳后增強了細胞攝取作用；且經半乳糖配體修飾的微乳組Gal(oct)-C-MEs、Gal(but)-C-MEs熒光強度均強于C-MEs，提示C-MEs經Gal(oct)、Gal(but)表面修飾后進一步增強了細胞攝取作用。
　　（3）Gal(oct)-C-MEs與Gal(but)-C-MEs誘導HepG2細胞凋亡的作用研究
　　采用流式細胞儀考察Gal(oct)-C-MEs與Gal(but)-C-MEs體外

13、誘導HepG2細胞凋亡的作用，結果顯示在不同制劑組作用HepG2細胞12 h后，經流式檢測發(fā)現C-MEs、Gal(but)-C-MEs和Gal(oct)-C-MEs均顯著促進細胞凋亡，且Gal(but)-C-MEs、Gal(oct)-C-MEs促進HepG2細胞凋亡能力強于C-MEs；隨著薏苡仁油濃度的增加，促凋亡能力增強。
　　4.半乳糖酯修飾薏苡仁組分微乳體內肝腫瘤靶向性、抗腫瘤療效及安全性評價
　?。?）Gal(oct

14、)-C-MEs與Gal(but)-C-MEs在裸鼠體內的分布情況
　　選用HepG2荷瘤裸鼠模型，考察Gal(oct)-C-MEs與Gal(but)-C-MEs在裸鼠體內的分布情況。結果顯示，薏苡仁組分相關微乳在肝臟及腫瘤部位吸收分布均明顯改善，甚至在口服給藥48 h后微乳組在腫瘤部位仍有聚集，且Gal(oct)-C-MEs與Gal(but)-C-MEs在腫瘤部位聚集更加顯著，推測可能是靶配體與去唾液酸糖蛋白受體特異性結合的結果。

15、其中Gal(oct)-C-MEs最為顯著，因此后續(xù)實驗選擇肝腫瘤靶向性更好的Gal(oct)-C-MEs進行研究。
　?。?）Gal(oct)-C-MEs的體內抗腫瘤藥效
　　選用HepG2荷瘤裸鼠模型，考察Gal(oct)-C-MEs的體內抗腫瘤藥效。體內抗腫瘤結果顯示，經過Gal(oct)-C-MEs治療后，荷瘤裸鼠相比康萊特注射液（Kanglaite?）、Mixture、C-MEs組，生存時間最長，腫瘤生長抑制最明顯，

16、觀察期結束后的離體瘤重最輕。體內免疫學初步研究結果表明，Gal(oct)-C-MEs、Kanglaite?、Mixture、C-MEs組的TNF-α指標相對于生理鹽水組均有提高，均具有顯著差異（P<0.05）；表明機體的免疫應答致使TNF-α升高起免疫調節(jié)作用；Gal(oct)-C-MEs、Kanglaite?、Mixture、C-MEs組血清中IL-6的含量與生理鹽水組相比則無明顯變化，具體原因有待進一步探討。
　?。?）Gal

17、(oct)-C-MEs的安全性評價
　　采用全自動生化儀對上述裸鼠肝功能指標AST（谷草轉氨酶）、ALT(谷丙轉氨酶)、腎功能指標BUN（血尿素氮）進行測定，并采用全自動血液分析儀對裸鼠全血進行血常規(guī)測定。結果顯示，給藥組裸鼠全血肝功能指標ALT、AST及腎功能指標與生理鹽水組相比均未出現明顯差異。與生理鹽水組相比較，Gal(oct)-C-MEs、Mixture、C-MEs組WBC明顯升高，與康萊特注射液組比較，Gal(oct)-