1、目的：
　　心肌缺血再灌注損傷(MI/RI)是指心肌在較長時間缺血后再恢復血供時心肌損傷反而加重的病理現(xiàn)象。近年來，有研究發(fā)現(xiàn)MI/RI能夠引起一系列的炎癥反應和氧化應激損傷，嚴重影響患者的健康，這已經(jīng)引起多數(shù)臨床醫(yī)生的關(guān)注。
　　番茄紅素是一種類胡蘿卜素化合物，普遍富含于水果及蔬菜之中，是一種純天然抗氧化劑。它作用廣泛，例如，能夠提高抗氧化酶類的活性;維持正常細胞代謝;調(diào)節(jié)血脂等。
　　目前研究已證實，缺氧復氧可引起

2、心肌細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，致GRP78表達增加，通過激活CHOP、p-JNK、Capase-12表達增加，進而導致細胞凋亡的增加。而番茄紅素是否能通過抑制CHOP、p-JNK及Capase-12表達減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激從而對缺氧復氧心肌細胞起到保護作用尚不得知。
　　本文選用大鼠H9c2心肌細胞，行缺氧/復氧處理，制造缺氧/復氧模型，經(jīng)不同濃度的番茄紅素預處理產(chǎn)生心肌保護作用，明確最佳保護濃度的番茄紅素，用MTT檢測細胞存活率，流式細胞術(shù)檢測

3、細胞凋亡比例，檢測GRP78、CHOP、JNK、p-JNK及Casepase-12mRNA及蛋白表達水平，加用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激抑制劑4-苯基丁酸(4-phenylbutyric acid,4-PBA)及特異性激活劑毒胡蘿卜素內(nèi)酯(Thapsigargin，TG)，明確番茄紅素對H9C2心肌細胞缺氧復氧的保護作用與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的關(guān)系并探討番茄紅素發(fā)揮保護作用可能相關(guān)機制，為日后心肌缺血再灌注損傷的臨床治療提供新的思路。
　　方法：
　

4、　一、實驗材料
　　H9C2心肌細胞購自中國科學院上海細胞庫;番茄紅素購自大連美侖;毒胡蘿卜素、4-苯基丁酸鈉、MTT、DMSO購自美國Sigma公司;DMEM培養(yǎng)基購自Gibco;RIPA裂解液、羊抗兔IgG-HRP二抗購自碧云天;反轉(zhuǎn)錄酶、Taq PCR MasterMix購自BioTeke公司;凋亡檢測試劑盒、GRP78、CHOP、p-JNK、JNK、β-actin兔抗鼠一抗購自萬類生物，Caspase-12一抗購自北京博奧

5、森;實驗中所用其他試劑均為進口或國產(chǎn)分析純。
　　二、實驗方法
　?。ㄒ唬┓鸭t素對缺氧復氧H9C2心肌細胞的保護作用與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的關(guān)系
　　1.建立H9C2心肌細胞缺氧復氧模型
　　將H9C2心肌細胞隨機分為6組。(1)空白對照組;(2)缺氧4小時復氧0小時;(3)缺氧4小時復氧2小時;(4)缺氧4小時復氧4小時;(5)缺氧4小時復氧6小時;(6)缺氧4小時復氧8小時。置于三氣培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)。通過MTT法檢測不

6、同組H9C2心肌細胞的生存率，確立最佳的復氧時間Mh，建立缺氧復氧模型。
　　2.篩選最佳保護作用的番茄紅素濃度
　　以第一部分基礎建立的缺氧復氧模型進行實驗。
　　此部分實驗分8組:(1)空白對照組;(2)0μM番茄紅素預處理+H/R組(0μM番茄紅素孵育4h后缺氧4h復氧Mh);(3)1.25μM番茄紅素預處理+H/R組(1.25μM番茄紅素孵育4h后缺氧4h復氧Mh);(4)2.5μM番茄紅素預處理+H/R組（2

7、.5μM番茄紅素孵育4h后缺氧4h復氧Mh）;(5)5μM番茄紅素預處理+H/R組（5μM番茄紅素孵育4h后缺氧4h復氧Mh）;(6)10μM番茄紅素預處理+H/R組(10μM番茄紅素孵育4h后缺氧4h復氧Mh);(7)20μM番茄紅素預處理+H/R組(20μM番茄紅素孵育4h后缺氧4h復氧Mh);(8)球形脂聯(lián)素（globular adiponectin，gAd）預處理+H/R組（2μg/ml gAd培養(yǎng)1h后缺氧4h復氧Mh）。通過

8、MTT法檢測不同組H9C2心肌細胞的生存率，并與已驗證具有保護作用的gAd組相比較，篩選出最佳保護作用的番茄紅素濃度為ⅩμM。
　　3.實驗分為5組:(1)空白對照組;(2)番茄紅素組（ⅩμM番茄紅素孵育4h）;(3)H/R組（缺氧4h復氧Mh）;(4)番茄紅素+H/R組(ⅩμM番茄紅素孵育4h后缺氧4h復氧Mh);(5)gAd+H/R組(2μg/ml gAd孵育1h后缺氧4h復氧Mh)。光鏡下觀察各組細胞形態(tài);通過檢測各組H9C

9、2心肌細胞LDH活性、凋亡比例及GRP78表達水平，與已驗證通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激發(fā)揮保護作用的gAd組相比較明確番茄紅素對缺氧復氧H9C2心肌細胞保護作用與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的關(guān)系。
　?。ǘ┓鸭t素減輕缺氧復氧致H9C2心肌細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激發(fā)揮保護作用的相關(guān)機制
　　該部分實驗分為7組:(1)空白對照組;(2)番茄紅素組（ⅩμM番茄紅素孵育4h）;(3) H/R組（缺氧4h復氧Mh）;(4)番茄紅素+H/R組(ⅩμM番茄紅素孵育4h

10、后缺氧4h復氧Mh);(5)4-PBA+H/R組(預先加1 mM4-PBA孵育24h后缺氧4h復氧Mh);(6) TG組（3μM毒胡蘿卜素孵育24 h）;(7)番茄紅素+TG組（預先加ⅩμM番茄紅素孵育4h，再加3μM毒胡蘿卜素孵育24 h）。MTT法檢測不同組H9C2心肌細胞的生存率，流式細胞術(shù)檢測各組H9C2心肌細胞的凋亡比例，并進一步應用分子生物學的方法，從分子水平觀察番茄紅素對缺氧復氧H9C2心肌細胞GRP78，CHOP，JNK

11、，p-JNK及Caspase-12mRNA及蛋白的影響，探討番茄紅素對缺氧復氧致H9C2心肌細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的保護作用相關(guān)機制。
　　三、統(tǒng)計學處理
　　采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料采用均數(shù)±標準差進行描述，兩組間均數(shù)比較采用獨立樣本t檢驗;組間比較采用單因素方差分析(One-WayANOVA);多重比較采用LDS法，P＜0.01為差異具有顯著統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)果：
　?。ㄒ唬┟鞔_番茄紅素對缺氧

12、復氧H9C2心肌細胞的保護作用與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的關(guān)系
　　1.建立H9C2心肌細胞缺氧復氧模型
　　MTT法檢測不同組H9C2心肌細胞的生存率，在缺氧4小時、不同復氧時間下的H9C2心肌細胞生存率與對照組相比，各組生存率分別為:51.237±5.975％，57.787±11.364％，76.573±10.794％，60.761±7.851％，59.242±7.712％，差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，且缺氧4小時后復氧6小

13、時、8小時后生存率呈逐漸下降趨勢。經(jīng)分析缺氧4h復氧4h為最佳缺氧復氧時間，即H4hR4h為H9C2心肌細胞缺氧復氧模型。
　　2.篩選最佳保護作用的番茄紅素濃度
　　不同濃度的番茄紅素（0μM，1.25μM，2.5μM，5μM and20μM）處理H9C2心肌細胞，然后進行缺氧4小時復氧4小時處理，MTT法測各組H9C2心肌細胞生存率分別為51.086±14.386％,57.481±14.974％,64.445±11.94

14、2％,73.458±20.114％,84.192±12.490％，71.506±8.435％，與已證實有保護作用的gAd組(77.620±8.714％)相比，10μM番茄紅素具有最佳的保護作用。
　　光鏡下觀察各組細胞的形態(tài)，可見H9C2心肌細胞形態(tài)多樣，呈紡錘體形或多角形，折光性強。細胞伸出偽足，成簇生長。與空白對照組相比，缺氧復氧組H9C2心肌細胞細胞偽足縮短或消失，折光性下降。而番茄紅素預處理后能夠減輕缺氧復氧誘導的細胞形態(tài)

15、改變。檢測各組H9C2心肌細胞LDH活性、凋亡比例及GRP78表達水平，與已證實可通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激發(fā)揮保護作用的gAd組相比較，缺氧復氧組LDH活性、H9C2心肌細胞凋亡比例及GRP78蛋白表達水平明顯增加(P＜0.01)，而番茄紅素能明顯降低缺氧復氧導致的LDH活性、細胞凋亡比例及GRP78表達增加(P＜0.01)，并與gAd+缺氧復氧組相比差異不具有統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　（二）番茄紅素減輕缺氧復氧致H9C2心肌細

16、胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激發(fā)揮保護作用的相關(guān)機制
　　檢測不同組H9C2心肌細胞的生存率及凋亡比例，測定各組細胞GRP78，CHOP，JNK，p-JNK及Caspase-12mRNA及蛋白的表達水平。與對照組相比，缺氧復氧組及TG組細胞生存率明顯下降(P＜0.01);與缺氧復氧組相比，番茄紅素+缺氧復氧組與4-PBA+缺氧復氧組細胞生存率明顯增高(P＜0.01);與TG組相比，番茄紅素+TG組細胞生存率明顯增高(P＜0.01);而番茄紅素+缺氧

17、復氧組與4-PBA+缺氧復氧組細胞生存率差異不具有統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。與對照組相比，缺氧復氧組及TG組的細胞凋亡比例及GRP78、CHOP和Caspase-12mRNA表達量、GRP78、CHOP、p-JNK和Caspase-12蛋白表達量明顯增加(P＜0.01);與缺氧復氧組相比，上述指標在番茄紅素+缺氧復氧組與4-PBA+缺氧復氧組明顯下降(P＜0.01);與TG組相比，在番茄紅素+TG組也明顯下降(P＜0.01);而番茄紅

18、素+缺氧復氧組與4-PBA+缺氧復氧組相比差異不具有統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。分析各組JNK mRNA及蛋白表達，結(jié)果示JNK mRNA及蛋白總量表達未見明顯變化，各組差異不具有統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　結(jié)論：
　?。ㄒ唬┓鸭t素可以通過減輕缺氧復氧致H9C2心肌細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激而發(fā)揮保護作用。
　?。ǘ┓鸭t素通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激致凋亡的關(guān)鍵信號通路CHOP、p-JNK和Caspase-12的表達對缺氧復氧H