1、目的:
　　探討miR-146a對(duì)巨核細(xì)胞裂解產(chǎn)生的血小板免疫炎癥功能的影響及miR-146a對(duì)血小板免疫炎癥功能調(diào)控作用的機(jī)制。
　　方法：
　?。?）通過體外培養(yǎng)雙分化潛能的K562細(xì)胞，采用佛波酯（Phorbol-12-myristate-13-acetate,PMA）誘導(dǎo)其向巨核細(xì)胞系分化，并最終可產(chǎn)生血小板；
　　（2）通過向分化的巨核細(xì)胞內(nèi)分別導(dǎo)入miR-146a模擬物和阻遏物，轉(zhuǎn)染設(shè)置5個(gè)組，正常對(duì)

2、照組：佛波酯誘導(dǎo)K562細(xì)胞產(chǎn)生血小板組；miR-146amimic組：miR-146a模擬物導(dǎo)入佛波酯誘導(dǎo)K562細(xì)胞產(chǎn)生血小板組；miR-146ainhibitor組：miR-146a抑制物導(dǎo)入佛波酯誘導(dǎo)K562細(xì)胞產(chǎn)生血小板組；mimic-NC組：將miR-146a模擬物陰性對(duì)照導(dǎo)入佛波酯誘導(dǎo)K562細(xì)胞產(chǎn)生血小板組;inhibitor-NC組：將miR-146a抑制物陰性對(duì)照導(dǎo)入佛波酯誘導(dǎo)K562細(xì)胞產(chǎn)生血小板組。
　?。?/p>

3、3）用q-RT-PCR檢測(cè)各組細(xì)胞中miR-146a表達(dá)水平的變化；用ELISA檢測(cè)血小板免疫炎癥分子IL-6、TNF-α分子水平；用RT-PCR檢測(cè)各組細(xì)胞中血小板免疫炎癥分子——NF-ΚBmRNA表達(dá)水平；用WesternBlotting檢測(cè)各組細(xì)胞中血小板免疫炎癥分子——TLR4、NF-ΚB蛋白表達(dá)水平。
　?。?）利用三種常用的靶基因預(yù)測(cè)軟件（TargetScan;PicTar;miRanda）預(yù)測(cè)miR-146a可能作用

4、的靶基因，結(jié)合miR-146a在調(diào)控血小板免疫炎癥過程中的作用，在預(yù)測(cè)結(jié)果交集中篩選出IRAK1基因?yàn)闈撛诘陌谢颍?br>　?。?）通過熒光素酶報(bào)告基因法驗(yàn)證IRAK1是否含有miR-146a的靶位點(diǎn)；
　?。?）通過檢測(cè)過表達(dá)或抑制表達(dá)miR-146a后細(xì)胞中靶基因IRAK1mRNA水平及蛋白水平的變化，從而確定miR-146a對(duì)靶基因IRAK1的影響。
　　結(jié)果：
　　（1）佛波酯成功誘導(dǎo)k562細(xì)胞分化為產(chǎn)血小

5、板巨核細(xì)胞；
　?。?）與miR-146amimic陰性對(duì)照組相比，miR—146amimic組miR—146a的表達(dá)顯著升高（約77.5倍），細(xì)胞上清液中IL-6、TNF-a顯著降低（p<0.05）；TLR4蛋白表達(dá)顯著升高（P<0.05），NF-KBmRNA及NF-KB蛋白明顯降低(P<0.05)；與miR-146ainhibitor陰性對(duì)照組相比，miR-146ainhibitor組miR-146a表達(dá)下降（約7.5倍），細(xì)

6、胞上清液中IL-6、TNF-a顯著升高（p<0.05）；TLR4蛋白表達(dá)顯著降低（P<0.05），NF-KBmRNA及NF-KB蛋白明顯升高(P<0.05)；
　?。?）生物信息軟件預(yù)測(cè)出IRAK1為hsa-mir-146a作用的靶基因；雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示，Pmir-Report-WT-IRAK1和miR-146amimic共轉(zhuǎn)染組的熒光素酶報(bào)告基因活性明顯受到抑制，而Pmir-Report-MUT-IRAK1和miR

7、-146amimic共轉(zhuǎn)染組、Pmir-Report-WT-IRAK1和mimic-NC共轉(zhuǎn)染組、Pmir-Report-MUT-IRAK1和mimic-NC共轉(zhuǎn)染組的熒光素酶報(bào)告基因活性均無(wú)明顯變化；miR-146a過表達(dá)可抑制IRAK1蛋白表達(dá)水平，而對(duì)IRAK1mRNA水平無(wú)影響。
　　結(jié)論：
　?。?）miR-146a調(diào)控血小板免疫炎癥分子IL-6、TNF-α的表達(dá)；
　?。?）證實(shí)miR-146a可能是通過其