1、目的:
　　通過建立體外血腫瘤屏障模型(blood-tumor barrier，BTB)，研究天然冰片通過MAPKs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路開放血腫瘤屏障的分子機(jī)制以及對(duì)BTB模型上緊密連接蛋白的調(diào)控作用;闡明天然冰片調(diào)節(jié)血腫瘤屏障開放的效果和機(jī)制，詮釋其“芳香開竅、引藥上行”的科學(xué)內(nèi)涵，也為臨床上神經(jīng)膠質(zhì)瘤等顱內(nèi)疾病的治療開辟一條新的途徑。
　　方法:
　　1.體外BTB細(xì)胞模型的建立。
　　大鼠C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞和人臍靜脈內(nèi)

2、皮細(xì)胞(HUVEC)非接觸共培養(yǎng)建立體外BTB細(xì)胞模型。
　　2.天然冰片對(duì)血腫瘤屏障模型通透性的影響
　　實(shí)驗(yàn)分4組:空白對(duì)照組、冰片低劑量組（25μg/mL）、冰片中劑量組（50μg/mL）、冰片高劑量組(100μg/mL)，每組3個(gè)復(fù)孔?？缂?xì)胞阻值和HRP流量測定不同劑量天然冰片對(duì)BTB通透性的影響。
　　3.天然冰片對(duì)MAPKs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)激酶表達(dá)的影響。
　　實(shí)驗(yàn)分4組:空白對(duì)照組、冰片低劑量組（2

3、5μg/mL）、冰片中劑量組(50μg/mL)、冰片高劑量組(100μg/mL)，每組3個(gè)復(fù)孔。Western blot檢測不同劑量的天然冰片對(duì)MAPKs通路相關(guān)激酶JNK、ERK、p38及其磷酸(p-JNK、p-ERK、和p-p38)表達(dá)的影響。
　　4.天然冰片和U0126合用對(duì)緊密連接相關(guān)蛋白、基因的表達(dá)及血腫瘤屏障通透性的影響。
　　選擇ERK信號(hào)通路特異性抑制劑U0126，實(shí)驗(yàn)分8組:空白對(duì)照組、冰片低劑量組(25

4、μg/mL)、冰片中劑量組（50μg/mL）、冰片高劑量組（100μg/mL）、U0126組、U0126+冰片低劑量組、U0126+冰片中劑量組、U0126+冰片高劑量組，每組3個(gè)復(fù)孔?？缂?xì)胞阻值和HRP流量測定不同組別的BTB通透性;Western blot檢測不同組別激酶ERK和p-ERK以及緊密連接相關(guān)蛋白Claudin-5、F-actin和ZO-1的表達(dá);RT-PCR檢測不同組別緊密連接相關(guān)基因Claudin-5、F-actin

5、和ZO-1的表達(dá)。
　　5.冰片和Sorafenib Tosylate(ST)合用緊密連接相關(guān)蛋白、基因的表達(dá)及血腫瘤屏障通透性的影響。
　　本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步對(duì)RAF/MEK/ERK信號(hào)通路的上游RAF位點(diǎn)進(jìn)行研究。選擇Raf特異性抑制劑ST，實(shí)驗(yàn)分8組:空白對(duì)照組、冰片低劑量組(25μg/mL)、冰片中劑量組(50μg/mL)、冰片高劑量組(100μg/mL)、ST組、ST+冰片低劑量組、ST+冰片中劑量組、ST+冰片高劑量組

6、，每組3個(gè)復(fù)孔?？缂?xì)胞阻值和HRP流量測定各組別的BTB通透性:Western blot檢測各組別激酶Raf1和p-Raf1以及緊密連接相關(guān)蛋白Claudin-5、F-actin和ZO-1的表達(dá);RT-PCR檢測各組別緊密連接相關(guān)基因Claudin-5、F-actin和ZO-1的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1.成功建立了體外BTB細(xì)胞模型，可模擬體內(nèi)血腫瘤屏障環(huán)境，用于藥物跨血腫瘤屏障特性方面的研究。
　　2.跨細(xì)胞阻值測

7、定天然冰片對(duì)BTB細(xì)胞模型通透性的影響，結(jié)果顯示:與空白對(duì)照組相比，天然冰片低、中、高劑量組(25、50、100μg/mL)的細(xì)胞電阻值均隨著作用時(shí)間的延長先逐漸降低，各組均在30min降低最明顯，120-240min時(shí)逐漸恢復(fù)正常水平。同一時(shí)間點(diǎn)電阻值的變化呈現(xiàn)劑量依賴趨勢(P＜0.01)。HRP流量測定天然冰片對(duì)BTB細(xì)胞模型通透性的影響，結(jié)果顯示:與空白對(duì)照組相比，天然冰片低、中、高(25、50、100μg/mL)的HRP通透率均

8、隨著作用時(shí)間的延長逐漸提高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);且同一時(shí)間點(diǎn)HRP通透率的提高呈現(xiàn)劑量依賴趨勢，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。從相鄰時(shí)間點(diǎn)的透過率差值分析，低、中、高劑量組均在10-30min、30-60min時(shí)，HRP透過率提升最明顯，60-120min時(shí)通透率增加幅度降低，120-240min時(shí)，通透率恢復(fù)正常水平。
　　3.Western blot檢測天然冰片對(duì)MAPKs信號(hào)通路激酶ERK、p-ERK、p38、

9、p-p38、JNK、p-JNK表達(dá)的影響，結(jié)果顯示:ERK蛋白在不同時(shí)間點(diǎn)間及不同組別間沒有顯著性的變化，p-ERK蛋白的表達(dá)量隨作用時(shí)間的延長先升高，然后又逐漸恢復(fù)至藥前水平，30min時(shí)表達(dá)量最高，并且存在劑量依賴性（p＜0.05; p38、p-p38蛋白在不同時(shí)間點(diǎn)間及不同組別間沒有顯著性的變化;JNK蛋白在不同時(shí)間點(diǎn)間及不同組別間沒有顯著性的變化，p-JNK蛋白表達(dá)在120min內(nèi)無明顯變化，180-240min開始明顯降低，且

10、存在一定的劑量依賴趨勢(p＜0.05)。
　　4.細(xì)胞電阻值測定結(jié)果顯示:與空白對(duì)照組相比，U0126組的細(xì)胞電阻值明顯升高，冰片組的細(xì)胞電阻值降低，差異具有具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.01);與冰片組相比，U0126合用組的細(xì)胞阻值明顯升高(p＜0.05)。HRP流量測定結(jié)果顯示:與空白對(duì)照組相比，U0126組的HRP通透率明顯降低，冰片各組的HRP通透率明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.01);與冰片組相比，U0126合用組的

11、HRP通透率明顯降低(p＜0.05)。Western blot測定ERK、p-ERK蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示:與空白對(duì)照組相比， U0126組的p-ERK表達(dá)明顯降低(p＜0.01)，冰片各組的ERK、p-ERK表達(dá)明顯升高(p＜0.01);與冰片組相比，U0126合用組的ERK、p-ERK表達(dá)明顯降低(p＜0.05); Western blot測定Claudin-5、ZO-1、F-actin蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示:與空白對(duì)照組相比，U0126組

12、的Claudin-5、-ZO-1、F-actin的蛋白表達(dá)明顯升高，冰片組的Claudin-5、ZO-1、F-actin的蛋白表達(dá)明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.01);與冰片組相比，U0126合用組的Claudin-5、ZO-1、F-actin的蛋白表達(dá)均明顯升高(p＜0.05)。RT-PCR測定Claudin-5、ZO-1、F-actin的基因表達(dá)變化，結(jié)果顯示:與空白對(duì)照組相比，U0126組的Claudin-5、ZO-1、F

13、-actin基因表達(dá)明顯升高，冰片組的Claudin-5、ZO-1、F-actin基因表達(dá)明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.01）;與冰片組相比，U0126合用組的Claudin-5、ZO-1、F-actin的基因表達(dá)均明顯升高，與蛋白變化結(jié)果一致。
　　5.跨細(xì)胞電阻值測定結(jié)果顯示:與空白對(duì)照組相比，ST組的細(xì)胞電阻值明顯升高，冰片組的細(xì)胞電阻值明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.01);與冰片組相比，ST合用組的細(xì)胞電阻

14、值明顯升高(p＜0.05)。HRP流量測定結(jié)果顯示:與空白對(duì)照組相比，ST組的HRP通透率明顯降低，冰片組的HRP通透率明顯提高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.01);與冰片組相比，ST合用組的通透率明顯降低(p＜0.05)。Western blot方法測定Raf1、p-Raf1的蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示:與空白對(duì)照組相比，ST組的Raf1、p-Raf1表達(dá)明顯降低，冰片組的Raf1、p-Raf1表達(dá)明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.01)

15、;與冰片組相比，ST合用組的Raf1與p-Raf1表達(dá)明顯降低(p＜0.05)。Western blot方法測定緊密連接蛋白Claudin-5、ZO-1、F-actin的蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示:與空白對(duì)照組相比，ST組蛋白Claudin-5、ZO-1、F-actin的表達(dá)明顯升高，冰片組的Claudin-5、ZO-1、F-actin的表達(dá)明顯減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.01);與冰片組相比，ST合用組的Claudin-5、ZO-1、F

16、-actin的蛋白表達(dá)均明顯升高(p＜0.05)。RT-PCR測定Claudin-5、ZO-1、F-actin的基因表達(dá)，結(jié)果顯示:與空白對(duì)照組相比，ST組的Claudin-5、ZO-1、F-actin基因表達(dá)明顯升高，冰片組的Claudin-5、ZO-1、F-actin基因表達(dá)明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.01);與冰片組相比，ST合用組的Claudin-5、ZO-1、F-actin的基因表達(dá)均明顯升高，趨勢與蛋白變化一致。<