1、背景及目的:
　　脊髓損傷(Spinal cord injury，SCI)是一種嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)性損傷，通常會(huì)引起機(jī)體的永久性癱瘓，同時(shí)直接導(dǎo)致脊髓微血管損傷和血脊髓屏障(Bloodspinal cord barrier，BSCB)通透性的破壞。BSCB主要由無窗孔的內(nèi)皮細(xì)胞、基底膜、周皮細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞終足組成，它能夠?yàn)榧顾柚械募?xì)胞成分提供特殊的微環(huán)境，從而對(duì)脊髓起到保護(hù)和調(diào)節(jié)作用;目前很多實(shí)驗(yàn)研究顯示BSCB通透性的改變參與了

2、SCI的病理發(fā)生發(fā)展過程，神經(jīng)毒性物質(zhì)和炎癥細(xì)胞通過BSCB從而引起膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞的“程序性死亡”，進(jìn)而導(dǎo)致永久性神經(jīng)缺陷。表皮生長因子(Epidermal growth factor，EGF)由53個(gè)氨基酸組成的6 kD多肽，其受體廣泛存在于哺乳動(dòng)物體內(nèi)，具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，包括促細(xì)胞增殖、遷移、分化等。同時(shí)作為一種神經(jīng)營養(yǎng)因子，它具有促進(jìn)神經(jīng)元生長及保護(hù)神經(jīng)元的作用。研究發(fā)現(xiàn)，EGF可促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞的增

3、殖分化，刺激膠原酶和血纖溶酶激活物的釋放，促進(jìn)上皮細(xì)胞的遷移并促進(jìn)其分裂增生、毛細(xì)血管的形成，從而為組織修復(fù)提供豐富的血液營養(yǎng)。我們研究結(jié)采發(fā)現(xiàn)EGF可以促進(jìn)大鼠SCI后BSCB的修復(fù)，進(jìn)一步研究EGF的作用機(jī)制發(fā)現(xiàn):EGF促進(jìn)大鼠SCI后BSCB的修復(fù)是通過激活PI3K/Akt/Rac1信號(hào)通路介導(dǎo)的。
　　方法及結(jié)果:
　　(1)采用打擊型方法來制作SD大鼠急性脊髓損傷動(dòng)物模型，即用脊髓打擊器(150 kdyn)打擊脊髓

4、T8～10段造成中度脊髓損傷模型。將雌性SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、SCI組、SCI+EGF組，根據(jù)不同時(shí)間點(diǎn)又分為1d，3d，7d，14d四組，采用BBB行為學(xué)評(píng)分對(duì)其后肢運(yùn)動(dòng)功能進(jìn)行評(píng)價(jià)。發(fā)現(xiàn)給予SCI+EGF組3d，7d，14d的BBB評(píng)分優(yōu)于SCI組，說明EGF能促進(jìn)大鼠脊髓損傷后運(yùn)動(dòng)功能的部分恢復(fù)。隨后于1d，7d兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)處死大鼠，收集約1cm脊髓損傷節(jié)段作為組織標(biāo)本分別用于冰凍切片觀察伊文思藍(lán)(Evans Blue，EB)熒

5、光、石蠟包埋切片HE染色、免疫熒光、Western blot以及其他指標(biāo)的檢測。從HE染色切片上觀察脊髓損傷后細(xì)胞形態(tài)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SCI+EGF組的損傷脊髓組織出血、核固縮等損傷比SCI組明顯減輕。根據(jù)EB染色發(fā)現(xiàn)，SCI破壞了大鼠的BSCB，導(dǎo)致脊髓損傷周圍的EB滲透量明顯增加，檢測其熒光強(qiáng)度也顯著增大。而SCI+EGF組發(fā)現(xiàn)EB滲透量和熒光強(qiáng)度明顯降低，Western blot檢測BSCB相關(guān)蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SCI+EGF組的

6、緊密連接蛋白（Claudin-5、Occludin）和粘附蛋白（p120-Catenin、β-Catenin）的表達(dá)明顯升高相對(duì)于SCI組，表明EGF對(duì)大鼠血腦屏障具有保護(hù)作用。在體外實(shí)驗(yàn)中，我們用糖氧剝奪模型(Oxygen GlucoseDeprivation，OGD)作用人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(Human brain microveselendothelia cells，HBMECs)模擬體內(nèi)BSCB模型，用FITC-dextran檢測

7、通透性，用免疫熒光法以及Western blot法檢測細(xì)胞蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)HBMECs在OGD作用之后FITC-dextran滲透量增加，緊密連接蛋白和粘附蛋白下調(diào)，而給予EGF組可以減少FITC-dextran滲透量和促進(jìn)細(xì)胞緊密連接蛋白、粘附蛋白的上調(diào)。
　　(2)在發(fā)現(xiàn)EGF對(duì)SCI后BSCB具有修復(fù)作用，為了進(jìn)一步探索EGF是通過何種機(jī)制來對(duì)BSCB起到保護(hù)作用的。結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，發(fā)現(xiàn)EGF可以激活PI3K/Ak

8、t信號(hào)通路，同時(shí)Rac1能夠參與對(duì)緊密連接蛋白和粘附蛋白的調(diào)節(jié)，結(jié)合本課題實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)SCI后p-Akt/Akt和Rac1這兩個(gè)蛋白表達(dá)下調(diào)，這一結(jié)果在體外BSCB模型得到了驗(yàn)證。因此，我們引入了PI3K/Akt抑制劑(LY294002)和Rac1 siRNA來進(jìn)一步證實(shí)EGF對(duì)PI3K/Akt和Rac1的調(diào)控作用。結(jié)果顯示當(dāng)分別阻斷這兩個(gè)通路時(shí)，EGF對(duì)BSCB的通透性和相關(guān)蛋白的保護(hù)作用都被部分抑制。這一結(jié)果在體外BSCB模型得到