1、目的:利用生物信息學技術(shù)預測、篩選和制備弓形蟲棒狀體蛋白2(ROP2)和膜表面蛋白1(SAG1)融合抗原免疫優(yōu)勢表位，分析以HPV16L1為載體攜帶融合抗原ROP2-SAG1優(yōu)勢表位的免疫效應研究。
　　方法:基于弓形蟲融合抗原ROP2-SAG1氨基酸序列的基礎上，利用Protean軟件，分析ROP2-SAG1的親水性，表面可及性，抗原指數(shù)及柔韌性;利用PORTER程序，將易于形成優(yōu)勢表位的β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)卷曲處確定出來，而將不易于

2、形成表位的α螺旋、β折疊區(qū)域排除。利用ABCPred軟件初步預測ROP2-SAG1分子中B細胞表位，結(jié)合抗原指數(shù)計算方法預測優(yōu)勢B細胞表位。利用Internet網(wǎng)絡資源的SYFP EITHI等預測軟件，綜合預測、篩選HLA限制性T細胞表位，篩選既是優(yōu)勢B細胞表位，同時又包含優(yōu)勢T細胞表位的優(yōu)勢表位。將優(yōu)勢表位相應基因片段克隆至pET32a(+)原核表達載體，轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌Roseta菌株（Roseta）中誘導表達，離子螯合親和層析柱(

3、Ni-NTA)純化表達產(chǎn)物，十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)鑒定表達產(chǎn)物。以純化的優(yōu)勢表位表達產(chǎn)物為免疫原，皮下多點注射日本大耳白兔，設pET32a(+)載體蛋白和PBS為對照，以純化的優(yōu)勢表位蛋白作包被抗原ELISA法檢測第0、2和4周免疫兔血清中表位特異性抗體IgG的產(chǎn)生時間及效價，免疫斑點實驗驗證免疫血清多克隆抗體的特異性。將優(yōu)勢表位相應基因片段克隆至真核表達載體pcDNA3.1(+)即構(gòu)成弓形蟲融合抗原ROP

4、2-SAG1優(yōu)勢表位(即pcDNA3.1(+)/ROP2-SAG1（multiepitope），在此基礎上將HPV16L1基因片段克隆至pcDNA3.1(+)/ROP2-SAG1（multiepitope）構(gòu)成pcDNA3.1(+)/ROP2-SAG1（multiepitope）/HPV16L1。構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒使用Lip-2000轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染COS-7細胞48h后，細胞提取RNA進行RT-PCR,以及收集細胞裂解液上清，進行West

5、ern blot鑒定，以及重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染COS-7細胞48h后進行免疫熒光鑒定其是否能夠在體外進行特異性的表達。構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒通過去內(nèi)毒素質(zhì)粒抽提試劑盒大量抽提，通過肌肉注射免疫方式連續(xù)三周免疫BALB/c小鼠，pcDNA3.1(+)作為陰性對照。ELISA法檢測第0，2，4和6周免疫小鼠血清中表位特異性抗體IgG的產(chǎn)生時間及效價，以及特異性抗體IgG不同亞類之間引起Th反應的區(qū)別。以及通過酶聯(lián)免疫斑點分析技術(shù)(ELISPOT)檢測免

6、疫鼠脾細胞γ干擾素產(chǎn)生能力。
　　結(jié)果:1.通過生物信息學軟件成功預測和篩選出以柔性肽相連接的一個88氨基酸序列，包含3個B細胞表位，3個HLA-A*0201限制性、2個HLA-A*2402限制性、1個HLA-DRB1*1501限制性、2個HLA-DRB1*0401限制性、2個HLA-DRB1*0301限制性T細胞表位，Blast-P分析與人、小鼠蛋白序列無同源性。
　　2.在原核表達體系中獲得了30KD大小的弓形蟲融合抗原

7、ROP2-SAG1優(yōu)勢表位融合表達產(chǎn)物。純化的表位蛋白免疫大耳白兔，血清中可檢測到相應的表位特異性抗體IgG，其抗體水平隨著免疫次數(shù)的增加而呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢，優(yōu)勢表位免疫組第2、4周兔血清抗體顯著高于載體pET32a(+)蛋白對照組（均P＜0.05），以第4周的免疫血清測定多克隆抗體效價可達1∶40960。通過免疫斑點試驗證實多克隆抗體針對優(yōu)勢表位具有良好的特異性。
　　3.重組質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)染COS-7細胞后，經(jīng)過RT-PCR檢測

8、證實重組質(zhì)粒能夠在體外細胞中成功轉(zhuǎn)錄，通過Western blot，和免疫熒光實驗證實其能夠在體外進行特異性表達。
　　4.重組質(zhì)粒免疫小鼠后，免疫血清能夠檢測到相應的表位特異性抗體IgG，其抗體水平隨著免疫次數(shù)的增加而呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢，優(yōu)勢表位免疫組以及優(yōu)勢表位/HPV16L1免疫組第2，4，6周小鼠血清抗體效價顯著高于pcDNA3.1(+)陰性質(zhì)粒對照組（均P＜0.05），且與優(yōu)勢表位免疫組相比優(yōu)勢表位/HPV16L1免疫組

9、的小鼠血清抗體效價顯著提高(P＜0.05)。以第4周的免疫血清測定多克隆抗體效價重組質(zhì)粒免疫組均可達1∶640。以pcDNA3.1(+)/ROP2-SAG1（multiepitope）/HPV16L1重組質(zhì)粒免疫組為例進行特異性抗體IgG亞類的測定，結(jié)果顯示從2周開始特異性抗體IgG1顯著高于IgG2a(P＜0.05)，指出弓形蟲融合優(yōu)勢表位誘導機體主要產(chǎn)生Th1反應。優(yōu)勢表位免疫鼠以及優(yōu)勢表位/HPV16L1免疫鼠脾細胞以3條特異性C

10、TL表位肽刺激后γ干擾素的產(chǎn)生水平分別為表位肽1（16.6±1.1/10萬細胞，25.13±1.81/10萬細胞）、表位肽2（21.6±1.7/10萬細胞，31.86±1.1/10萬細胞）、表位肽3（45.8±2.8/10萬細胞，66.93±2.1/10萬細胞），均顯著高于pcDNA3.1(+)陰性質(zhì)粒免疫對照組（均P＜0.05），且CTL表位聯(lián)合Th表位的組合肽刺激γ干擾素產(chǎn)生水平（表位肽3（45.8±2.8/10萬細胞，66.93±

11、2.1/10萬細胞）分別顯著高于兩組單獨的CTL表位肽刺激組（表位肽一16.6±1.1/10萬細胞，25.13±1.81/10萬細胞、表位肽二21.6±1.7/10萬細胞，31.86±1.1/10萬細胞）（均P＜0.05）。且與優(yōu)勢表位免疫組相比，優(yōu)勢表位/HPV16L1免疫組其特異性CTL表位肽刺激后γ干擾素的產(chǎn)生水平明顯升高(P＜0.05)。
　　結(jié)論:1.預測和篩選到了弓形蟲免疫優(yōu)勢T、B細胞表位人工合成弓形蟲融合抗原ROP

12、2-SAG1優(yōu)勢表位(即/ROP2-SAG1(multiepitope))。
　　2.成功構(gòu)建了原核表達重組質(zhì)粒pET32a(+)/ROP2-SAG1（multiepitope），真核表達重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/ROP2-SAG1(multiepitope)以及pcDNA3.1(+)/ROP2-SAG1(multiepitope)/HPV16L1
　　3.構(gòu)建成功的原核表達質(zhì)粒能夠在原核表達體系中進行表達，其表達產(chǎn)物