1、目的：通過抑制及過表達干擾素誘導蛋白Ifi204（Interferon Inducible Protein204，Ifi204），觀察其調(diào)控血管內(nèi)皮祖細胞（Endothelial Progenitor Cells，EPCs）增殖、分化和血管形成的能力。
　　方法：提取C57BL/6小鼠骨髓全部細胞，采用密度梯度離心法獲得骨髓單個核細胞，EBM-2培養(yǎng)基篩選培養(yǎng)獲得EPCs。使用DAPI染色和DiI-Ac-LDL內(nèi)吞、流式細胞術進行

2、EPCs鑒定。通過提取第3天到第14天EPCs的全部RNA，進行反轉錄-定量聚合酶鏈反應（RT-qPCR），結果顯示第7天EPCs表達基因Ifi204最高，確定轉染及轉導時間。于第7天進行siRNA轉染及慢病毒（Lenti-Virus，LV）轉導，分別獲得低表達Ifi204及過表達Ifi204的EPCs，并通過RT-qPCR進行轉染及轉導效果驗證。將正常組EPCs、過表達Ifi204組EPCs及低表達Ifi204組EPCs等三組細胞分別

3、抽提全部RNA，進行RT-qPCR、流式細胞檢測以及免疫熒光染色，驗證EPCs特異性分子標記物（包括CD31、VE-Cadherin、vWF等）表達水平。將三組細胞進行管樣形成實驗及克隆形成實驗，驗證EPCs的血管形成能力及克隆增殖活力。最后進行體內(nèi)實驗，建立C57BL/6小鼠下肢缺血模型，分別于缺血部位局部注射三組EPCs，其中正常組及siRNA組細胞使用TPE-11標記（TPE-11是新近合成了一種納米材料，由一個含有四苯乙烷的雙頭

4、基親分子和兩個含有吡啶鹽末端的烷基組成，簡稱TPE-11）、慢病毒組自帶GFP熒光，激光多普勒檢測手術當天及術后14天小鼠缺血下肢血流恢復情況，組織切片免疫熒光染色觀察缺血部位血管新生以及移植細胞存活量。
　　結果：DAPI染色和DiI-Ac-LDL內(nèi)吞、qPCR及流式細胞術驗證結果顯示EBM-2培養(yǎng)基培養(yǎng)獲得的細胞符合血管內(nèi)皮祖細胞的特性。熒光顯微鏡提示 siRNA轉染效率及Lenti-Virus轉導效率均在90％以上，RT-q

5、PCR提示siRNA抑制基因Ifi204表達量大于50%、Lenti-Virus使Ifi204表達量升高超過100%；流式細胞術以及免疫熒光染色提示siRNA組EPCs特異性分子標志物（包括CD31、VE-Cadherin、vWF等）表達明顯下降，Lenti-Virus組升高。功能實驗中，siRNA組血管形成能力較正常組明顯降低，Lenti-virus組較正常組升高；siRNA組增殖能力較正常組明顯降低，Lenti-Virus組較正常組

6、升高。成功建立C57BL/6小鼠下肢缺血模型，激光多普勒檢測驗證手術當天手術側下肢缺血明顯，術后14天激光多普勒顯示過表達Ifi204的EPCs治療的小鼠下肢血流較對側恢復情況較正常EPCs組為高，低表達Ifi204的EPCs治療的小鼠下肢血流較對側恢復明顯較正常EPC組為低。冰凍切片免疫熒光染色顯示過表達Ifi204 EPCs治療的小鼠移植細胞存活量較正常EPCs組為高，低表達Ifi204的EPCs治療的小鼠移植細胞存活量較正常EPC