1、目的：傳統(tǒng)理論中終末分化的細(xì)胞是不可逆的過程，不能轉(zhuǎn)化為其他已分化細(xì)胞。近年來，譜系重編技術(shù)為誘導(dǎo)終末分化細(xì)胞功能轉(zhuǎn)化開啟了一道大門，根據(jù)重編程過程的不同分為兩種方式，其中一種是誘導(dǎo)普通成體細(xì)胞轉(zhuǎn)化為多能干細(xì)胞，再誘導(dǎo)分化為新的細(xì)胞類型，稱為間接譜系重編；最新研究提示另一種重編程方法，直接譜系重編分化成熟細(xì)胞為其他類型的功能細(xì)胞。前期研究成果通過不同的慢病毒組合誘導(dǎo)，黑色素瘤細(xì)胞重編程為類神經(jīng)元細(xì)胞。這一直接譜系重編過程中是否存在主調(diào)控

2、基因及信號(hào)通路，本課題利用新一代轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)對(duì)誘導(dǎo)得到的類神經(jīng)元細(xì)胞進(jìn)行全轉(zhuǎn)錄組測序，研究黑色瘤細(xì)胞譜系重編機(jī)制，初步探討在誘導(dǎo)過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用的基因及信號(hào)通路，為改良譜系重編過程提供理論依據(jù)。
　　方法：譜系重編得到黑色瘤細(xì)胞來源的類神經(jīng)元細(xì)胞，原始細(xì)胞為A375細(xì)胞系，誘導(dǎo)過程中設(shè)立3組——4因子組、5因子組和對(duì)照組。利用4種已經(jīng)證實(shí)能夠誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞向類神經(jīng)元細(xì)胞轉(zhuǎn)化的因子（神經(jīng)母細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)移因子1(Achaete-s

3、cute homolog1，Ascl1)、成神經(jīng)分化因子1（Neurod1，neuronal differentiation1）、髓鞘轉(zhuǎn)錄因子1（Myelin transcription factor1，Myt1l）、大腦蛋白2（Brain protein2，Brn2，also called POU3F2））誘導(dǎo)A375細(xì)胞，5因子組慢病毒組合為Ascl1、Neurod1、Myt1l、Brn2和人腦源性神經(jīng)生長因子（Human brai

4、n-derived neurotrophic factor，h-BDNF），實(shí)驗(yàn)過程中以空載體慢病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞作為對(duì)照組?；诒菊n題前期實(shí)驗(yàn)成果，誘導(dǎo)得到的類神經(jīng)元細(xì)胞在第14天具有最佳的形態(tài)及類神經(jīng)元功能，因此在該時(shí)間點(diǎn)收集誘導(dǎo)后細(xì)胞，提取RNA上機(jī)測序，采用國際公認(rèn)算法DESeq進(jìn)行3組實(shí)驗(yàn)組兩兩差異基因的篩選。其中篩選時(shí)，設(shè)立Log2FC>0.585或<-0.585，Pvalue<0.05，F(xiàn)DR<0.05為顯著性差異基因。整合NC

5、BI、Swissprot/Uniprot、The Gene Ontology、AmiGO等多個(gè)數(shù)據(jù)庫的信息，對(duì)差異基因進(jìn)行GO分析和Pathway分析，根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)選出與細(xì)胞分化和神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育相關(guān)的 GO和 Pahtway進(jìn)行功能樹分析和信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，找出發(fā)揮關(guān)鍵作用的GO和Pathway，通過趨勢分析確定譜系重編過程中的主調(diào)控基因及信號(hào)通路，構(gòu)建基因及信號(hào)通路共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)驗(yàn)證結(jié)果。
　　結(jié)果：本課題利用5種因子不同組合（Asc

6、l1，Neurod1，Myt1l，Brn2，h-BDNF）誘導(dǎo)A375細(xì)胞成功向類神經(jīng)元細(xì)胞轉(zhuǎn)化。通過深度測序，我們得到4因子組、5因子組及對(duì)照組的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。在4因子組與對(duì)照組之間共有893個(gè)差異基因，5因子組與對(duì)照組之間共有512個(gè)差異基因，同時(shí)在4因子組與5因子組之間有409個(gè)差異基因。通過對(duì)差異基因進(jìn)行基因注釋，在眾多基因條目中與細(xì)胞分化及神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育相關(guān)的基因條目是顯著上調(diào)的。對(duì)信號(hào)通路注釋的結(jié)果提示PI3K及MAPK在4因子

7、組和5因子組中均表達(dá)上調(diào)，在基因互作網(wǎng)絡(luò)中這兩條信號(hào)通路的基因處于核心位置，因此可以初步推斷此兩條信號(hào)通路在A375細(xì)胞譜系重編過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。對(duì)4因子組及5因子組細(xì)胞差異信號(hào)通路分析中，證實(shí)以上推斷，MAPK在5因子組得到更高的表達(dá)，而基因及信號(hào)通路共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)中也證實(shí)在這兩條信號(hào)通路中促生長因子（insulin-like growth factors-1，IGF-1）顯著表達(dá)，是譜系重編過程中主調(diào)控基因之一。
　　結(jié)論：黑色