1、目的:
　　通過(guò)微生物遺傳學(xué)、生物化學(xué)與分子生物學(xué)等分析手段系統(tǒng)的研究，能夠闡述Cu2+在厭氧條件下對(duì)鐵硫簇組裝的影響以及Cu2+對(duì)大腸桿菌毒性比在有氧條件下增大的機(jī)制，從而為鐵硫簇組裝機(jī)制和銅的殺菌機(jī)制研究奠定了重要的理論基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1. 厭氧條件下銅離子毒性增大的驗(yàn)證及銅離子實(shí)驗(yàn)濃度的選定。
　　1)Cu2+實(shí)驗(yàn)濃度的選定
　　配制不同Cu2+濃度的LB平板，在平板上滴加OD600=0.05

2、的菌液，分別放在有氧和厭氧條件下37℃培養(yǎng)24小時(shí)，觀察菌落狀態(tài)及大小，初步驗(yàn)證厭氧條件下Cu2+毒性的增加及得到適合實(shí)驗(yàn)的Cu2+濃度。
　　2)生長(zhǎng)曲線的繪制
　　在有氧和厭氧條件下通過(guò)終點(diǎn)法測(cè)定大腸桿菌在不同Cu2+濃度LB液體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線，將有氧和厭氧條件下Cu2+對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的影響量化，并得到實(shí)驗(yàn)Cu2+濃度。
　　2. 厭氧條件下Cu2+對(duì)多種鐵硫簇組裝影響的的驗(yàn)證。
　　2.1 [4Fe-4S]

3、蛋白IlvD的表達(dá)，純化及活性測(cè)定
　　1)設(shè)置四種實(shí)驗(yàn)環(huán)境，有氧不加Cu2+，有氧加200μM Cu2+，厭氧不加Cu2+，厭氧加200μM Cu2+。在四種條件下進(jìn)行IlvD的表達(dá)。蛋白質(zhì)經(jīng)Ni柱親和純化。純化后的蛋白用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描分析，并進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定和SDS-PAGE電泳分析。
　　2)蛋白鐵、硫、銅含量的測(cè)定
　　A.采用菲咯嗪法測(cè)定蛋白中的鐵含量:在L-cysteine的作用下，蛋白

4、樣品中的鐵釋放出來(lái)并與菲咯嗪(Ferrozine)結(jié)合形成Fe-Ferrozine絡(luò)合物，在564 nm處具有特征性吸收峰，其消光系數(shù)為27.9 mM-1cm-1，利用公式CFe=(OD564-OD700)*1000/27.9(單位:μM)求得鐵含量。
　　B.采用DPD法測(cè)定蛋白中的硫含量:硫化物與FeCl3相互作用，DPD(Ndiethyl-p-phenylenediamie)作為顯色劑，可在669 nm處形成特征性吸收峰，利

5、用公式及硫的消光系數(shù)即可算得蛋白中的硫含量。由于硫的消光系數(shù)不穩(wěn)定，以Nth（一種穩(wěn)定的[4Fe-4S]蛋白）為陽(yáng)性對(duì)照，用Nth計(jì)算硫的消光系數(shù)。根據(jù)公式計(jì)算硫含量: CS=(OD669-OD800)*1000/S消光系數(shù)(單位:μM)S消光系數(shù)=(OD669-OD800)*1000/Nth CSNth CS=Nth CFe=(OD564-OD700)*1000/27.9
　　C.銅含量測(cè)定參考Tutem的方法進(jìn)行改進(jìn)，160μ

6、L蛋白與10μL5 mMneocuproine（溶解在50％無(wú)水乙醇中）、20μL20％ SDS和10μL5 mM維生素C混合，室溫孵育30 min，離心，取上清測(cè)定。其在450 nm處具有特征性吸收峰，其消光系數(shù)為8.1 mM-1cm-1，利用公式CCu=(OD450-OD700)*1000/8.1（單位:μM）求得銅含量。
　　3)IlvD（二羥酸脫水酶）活性測(cè)定。
　　原理是IlvD催化底物D，L-2，3-二羥基-異戊

7、酸產(chǎn)生具有240 nm吸收峰的產(chǎn)物(酮酸，消光系數(shù)為0.19 mM-1cm-1)，利用分光光度計(jì)檢測(cè)240 nm來(lái)反映產(chǎn)物的生成量，從而計(jì)算IlvD酶的活性。具體方法是取純化后的IlvD10-20μL迅速加入含有50 mM Tris(pH8.0)、10 mM MgCl2和10mM底物的反應(yīng)液中，37℃反應(yīng)并監(jiān)測(cè)240 nm的吸光度2 min，通過(guò)計(jì)算2 min內(nèi)新生產(chǎn)物的生成量來(lái)得到IlvD的酶活力。
　　2.2 [4Fe-4S]

8、蛋白Nth和[2Fe-2S]蛋白FhuF和YeaW四種條件下的表達(dá)純化及全波長(zhǎng)掃描分析，并進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析和鐵、硫、銅含量的測(cè)定。
　　3. 厭氧條件下Cu2+對(duì)鐵硫簇組裝影響方式的研究。
　　在鐵硫蛋白表達(dá)前加Cu2+處理，鐵硫蛋白表達(dá)后洗去誘導(dǎo)劑然后再加銅處理。分別純化蛋白，純化后的蛋白進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描分析，SDS-PAGE電泳分析以及鐵，硫，銅含量的測(cè)定。
　　4. 厭氧條件下Cu2+對(duì)在iscA突變菌

9、和iscU突變菌中表達(dá)的Nth的影響。在iscA突變菌，iscU突變菌中表達(dá)純化Nth蛋白，分四個(gè)實(shí)驗(yàn)條件，有氧不加Cu2+，有氧加200μM Cu2+，厭氧不加Cu2+，厭氧加200μM Cu2+。表達(dá)純化后的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析以及鐵、硫、銅含量的測(cè)定。
　　5. 厭氧條件下Cu2+對(duì)IscA蛋白，IscU蛋白和IscS蛋白的影響。
　　5.1 IscA在有氧不加Cu2+，有氧加200μM Cu2+，厭氧不加

10、Cu2+，厭氧加200μMCu2+條件下的表達(dá)純化，全波長(zhǎng)掃描分析，SDS-PAGE電泳分析以及鐵、硫、銅含量的測(cè)定。
　　5.2 IscU在有氧不加Cu2+，有氧加200μM Cu2+，厭氧不加Cu2+，厭氧加200μMCu2+條件下的表達(dá)純化，全波長(zhǎng)掃描分析，SDS-PAGE電泳分析以及銅含量的測(cè)定。
　　5.3 IscS在有氧不加Cu2+，有氧加200μM Cu2+，厭氧不加Cu2+，厭氧加200μMCu2+條件下的表

11、達(dá)純化，全波長(zhǎng)掃描分析，SDS-PAGE電泳分析以及IscS活性測(cè)定。將純化的IscS與L-cysteine、DTT在37℃條件下進(jìn)行孵育， IscS可催化底物L(fēng)-cysteine脫硫，在DTT存在的條件下形成H2S，H2S與FeCl3相互作用，DPD(N-diethyl-p-phenylenediamie)作為顯色劑，可在669 nm處形成特征性吸收峰，利用公式及硫的消光系數(shù)即可算得蛋白中的硫含量，硫含量的多少可以直接反映IscS活性

12、的大小。
　　6. 厭氧條件下IscA蛋白和IscU蛋白體內(nèi)銅離子梯度結(jié)合研究。
　　在厭氧條件下設(shè)置不同濃度的銅離子梯度(0μM，50μM，100μM，200μM)，進(jìn)行IscA和IscU蛋白的表達(dá)和純化，純化后的蛋白進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描分析，SDS-PAGE電泳分析以及鐵，硫，銅含量的測(cè)定。
　　7. 厭氧條件下IscA蛋白和IscU蛋白體外銅離子梯度結(jié)合研究。
　　7.1 在M9培養(yǎng)基中表達(dá)純化IscA，制備ap

13、o-IscA蛋白。在體外條件下設(shè)置銅離子梯度(0μM，25μM，50μM，100μM，200μM，300μM)，加入25μMBSA，25μM apo-IscA，2 mM DTT分別在有氧和厭氧環(huán)境下處理30min，并進(jìn)行重新純化，純化后的蛋白進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描分析，SDS-PAGE電泳分析以及銅含量的測(cè)定。
　　7.2 在LB培養(yǎng)基中表達(dá)純化IscU，制備apo-IscU蛋白。在體外條件下設(shè)置不同濃度的銅離子梯度(0μM，100μM，

14、200μM，400μM，600μM，800μM)，加入25μM BSA，25μM apo-IscU，2 mM DTT分別在有氧和厭氧環(huán)境下處理30 min，重新純化，純化后的蛋白進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描分析，SDS-PAGE電泳分析以及銅含量的測(cè)定。
　　結(jié)果:
　　1. 平板37℃生長(zhǎng)24h取出后，在有氧狀態(tài)下，觀察到野生MC4100在2 mM銅離子濃度下，菌落狀態(tài)仍然正常。在厭氧條件下，200μM銅離子處理后菌落狀態(tài)仍然正常，50

15、0μM處理后菌落若隱若現(xiàn)。通過(guò)平板實(shí)驗(yàn)看出厭氧條件下相同濃度的Cu2+對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)產(chǎn)生了更大的影響。初步選取了200μM Cu2+濃度為實(shí)驗(yàn)濃度。在進(jìn)一步的生長(zhǎng)曲線實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，200μM Cu2+濃度在厭氧條件下對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)影響不大，抑制了僅有20％。
　　2. 純化后的[4Fe-4S]蛋白Nth（核酸內(nèi)切酶Ⅲ）和IlvD（二羥酸脫水酶），[2Fe-2S]蛋白FhuF和YeaW進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描結(jié)果發(fā)現(xiàn)，同樣加200μM Cu2+，LB中誘

16、導(dǎo)表達(dá)的[4Fe-4S]蛋白Nth和IlvD在厭氧條件下其鐵硫簇的吸收峰(419nm)明顯下降，對(duì)純化后蛋白鐵、硫含量測(cè)定及對(duì)IlvD進(jìn)一步活性測(cè)驗(yàn)也顯示同樣的結(jié)果。而[2Fe-2S]蛋白FhuF和YeaW卻沒(méi)有明顯下降。純化后蛋白鐵、硫含量測(cè)定也沒(méi)有發(fā)生明顯改變，初步得出結(jié)論:厭氧條件下200μM Cu2+對(duì)[4Fe-4S]蛋白毒性顯著增強(qiáng)。
　　3. 在四個(gè)實(shí)驗(yàn)條件下分別從iscA突變菌，iscU突變菌和野生MC4100中純化

17、出Nth蛋白，通過(guò)全波長(zhǎng)掃描發(fā)現(xiàn)同樣加200μM Cu2+在iscA突變菌和iscU突變菌中表達(dá)純化的Nth蛋白其鐵硫簇的吸收峰(419 nm)幾乎消失，對(duì)蛋白的鐵、硫含量的測(cè)定也證實(shí)了該結(jié)果。
　　4. 在先加銅處理后誘導(dǎo)表達(dá)Nth蛋白及先誘導(dǎo)表達(dá)Nth蛋白后再加銅處理的實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)全波長(zhǎng)掃描發(fā)現(xiàn)，先加銅后誘導(dǎo)表達(dá)的Nth蛋白其鐵硫簇的吸收峰(419nm)明顯下降，而誘導(dǎo)表達(dá)后再加銅的Nth蛋白其鐵硫簇的吸收峰(419nm)沒(méi)有

18、明顯改變。說(shuō)明了厭氧條件下Cu2+對(duì)[4Fe-4S]產(chǎn)生的毒性是影響了鐵硫蛋白合成的通路，而不是對(duì)已經(jīng)合成的[4Fe-4S]蛋白產(chǎn)生毒性。
　　5. 鐵硫簇組裝通路中的IscA，IscU和IscS（半胱氨酸脫硫酶）蛋白的全波長(zhǎng)掃描發(fā)現(xiàn)IscA，IscU蛋白在厭氧條件下加200μM Cu2+，其Cu2+結(jié)合峰(258nm)明顯升高，通過(guò)對(duì)蛋白銅含量的測(cè)定也顯示同樣結(jié)果。而IscS沒(méi)有變化，其活性測(cè)定也顯示沒(méi)有影響。
　　6.

19、厭氧條件下，在LB中添加不同濃度的銅離子（0μM，50μM，100μM，200μM）表達(dá)IscA和IscU蛋白并純化，對(duì)純化后的蛋白進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描分析其Cu2+結(jié)合峰(258 nm)逐漸升高，銅結(jié)合量也是逐漸升高。
　　7. apo-IscA和apo-IscU蛋白在體外銅離子梯度處理后，重新純化，重新純化后的IscA和IscU蛋白經(jīng)過(guò)Cu含量測(cè)定，有氧條件下，顯示IscA在加入200μM銅離子后曲線漸平，說(shuō)明其銅離子結(jié)合量趨于飽和

20、，每個(gè)IscA結(jié)合約2個(gè)銅。厭氧條件下在加入50μM銅離子后曲線就開(kāi)始平緩，銅離子結(jié)合量趨于飽和，每個(gè)IscA結(jié)合約2個(gè)銅。IscU有氧條件下在加入400μM銅離子后曲線漸平，說(shuō)明其銅離子結(jié)合量趨于飽和接近于每個(gè)蛋白結(jié)合1個(gè)銅。厭氧條件下在加入800μM銅離子后曲線仍然上升。
　　結(jié)論:
　　1. MC4100和Ecoii CusA-CopA-CueO-/MC4100在厭氧條件下對(duì)銅離子的敏感度都比有氧條件下對(duì)銅離子的敏感高

21、。其中MC4100有氧條件下Cu2+濃度在2 mM時(shí)菌落仍然正常，但是在厭氧條件下500μM時(shí)細(xì)菌生長(zhǎng)就已經(jīng)完全抑制。
　　2. 厭氧條件下銅離子對(duì)鐵硫簇的影響只體現(xiàn)在[4Fe-4S]鐵硫簇的組裝，而不影響[2Fe-2S]鐵硫簇的組裝。
　　3. 厭氧條件下銅能夠有效的抑制LB培養(yǎng)基生長(zhǎng)的E.coli中[4Fe-4S]鐵硫簇的組裝，但對(duì)已經(jīng)組裝好的鐵硫簇沒(méi)有明顯的影響。
　　4. 厭氧條件下，在野生菌MC4100和is