1、目的:
　　本課題將通過多中心、隨機(jī)、對照的臨床研究來探討CVVH和ULI在嚴(yán)重膿毒癥中的治療效果。并在內(nèi)皮細(xì)胞模型上進(jìn)一步探討CVVH和ULI對內(nèi)皮細(xì)胞通透性的影響及其機(jī)制。
　　方法:
　　一、臨床研究
　　1.研究對象
　　多中心（鄭州市第三人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科、廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科、河南省傳染病院重癥醫(yī)學(xué)科、解放軍309醫(yī)院血液凈化中心）、隨機(jī)，研究時(shí)間為2013年6月1日至2014年12月3

2、0日。
　　2.納入標(biāo)準(zhǔn):
　　(1)符合膿毒癥休克診斷標(biāo)準(zhǔn);
　　(2)年齡＞18歲，＜75歲;
　　(3)入院治療時(shí)間＞24小時(shí);
　　(4)患者或者家屬已簽署之情同意書。
　　3.排除標(biāo)準(zhǔn):
　　(1)患者血流動力學(xué)極不穩(wěn)定，無法耐受血濾;
　　(2)入院72小時(shí)內(nèi)死亡的;
　　(3)患者或家屬拒絕參加臨床試驗(yàn)或拒絕簽署知情同意書;
　　(4)合并急性心臟損傷或者腦卒中患

3、者;
　　(5)因故中途更改治療方案。
　　4.研究分組:
　　采用計(jì)算機(jī)隨機(jī)數(shù)技術(shù)將患者隨機(jī)分為4組，即常規(guī)治療組(control)、連續(xù)血濾組(CVVH)、烏司他丁組(ULI)、連續(xù)靜脈-靜脈血濾+烏司他丁組(CVVH-ULI)。其中對照組按照2012膿毒癥指南進(jìn)行治療，若患者出現(xiàn)腎衰，可采用常規(guī)方案進(jìn)行血液透析;CVVH組在按照2012膿毒癥指南進(jìn)行治療的同時(shí)同時(shí)做CVVH; ULI組按照2012膿毒癥指南進(jìn)行治

4、療基礎(chǔ)上，每日分2次靜脈輸注烏司他丁，每次20萬單位;CVVH-ULI即采用CVVH的同時(shí)聯(lián)合使用烏司他丁。
　　5.一般治療方案:
　　各組確診為膿毒癥后即按照2012膿毒癥指南進(jìn)行早期目標(biāo)治療，急性腎衰患者可按照常規(guī)腎替代進(jìn)行透析。
　　6.血液濾過配置:確診膿毒癥休克2小時(shí)內(nèi)即開始血液濾過治療。采用頸內(nèi)靜脈或股靜脈置管，留置三腔深靜脈導(dǎo)管（美國ARROW公司生產(chǎn)）。采用連續(xù)性靜脈-靜脈血液濾過(CVVH)治療。C

5、VVH治療機(jī)器為百特公司生產(chǎn)Aquarius血濾機(jī)，應(yīng)用polyflux14S（膜面積1.4平方米）及配套管路，每24小時(shí)更換1次濾器，共治療72小時(shí)。置換量40ml/kg.h，采用前稀釋方式。血液流量為200ml/min。使用肝素抗凝，使用前血濾機(jī)先以生理鹽水3000ml以及肝素20mg預(yù)沖30min，然后以起始用量為3000IU，隨后500IU/h靜脈輸注，隨凝血指標(biāo)調(diào)整肝素用量，對有出血傾向的患者采用無肝素治療。
　　7.一

6、般主要記錄指標(biāo):年齡、性別、心率、血壓、氧飽和度、呼吸、APACHII評分和SOFA評分。
　　8.升壓藥物用量:于患者入院后至納入研究前以及治療72小時(shí)后的多巴胺和去甲腎上腺素用量。
　　9.生化指標(biāo)檢測:于患者入院后至納入研究前以及治療72小時(shí)后抽血查肝功ALT、AST、TBIL及DBIL，腎功Cr、BUN及cys C、心臟生化Tn及CK-MB、血?dú)夥治?、IL-6、TNF-α、vWF和E-選擇素。
　　10.病情嚴(yán)

7、重程度評分:于患者入院后至納入研究前以及治療72小時(shí)后進(jìn)行APACHII評分和SOFA評分。
　　11.預(yù)后:觀察ICU死亡率、院內(nèi)死亡率和28天死亡率。
　　12.ELISA檢測vWF、E-選擇素、IL-6、TNF-α。
　　二、細(xì)胞學(xué)研究
　　取上述各組患者血清，與人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)。用FITC-白蛋白滲漏法檢測內(nèi)皮細(xì)胞通透性，用羅丹明-鬼筆環(huán)肽染色檢測內(nèi)皮細(xì)胞骨架;用Annexin-PI染色和流式細(xì)胞儀

8、檢測內(nèi)皮細(xì)胞凋亡;用western-blot檢測p38、ERK和JNK蛋白表達(dá)及其磷酸化水平。
　　結(jié)果:
　　臨床研究部分:(1)治療前各組之間的年齡、性別、呼吸機(jī)使用情況、既往患糖尿病、高血壓、慢性腎病情況，白細(xì)胞、降鈣素原、C反應(yīng)蛋白、乳酸水平，多巴胺、去甲腎上腺素用量，APACHII和SOFA參數(shù)，PiCCO檢測的中心靜脈壓(CVP)、胸腔內(nèi)血指數(shù)(ITBI)、血管外肺水指數(shù)(ELWI)、外周血管阻力指數(shù)(SVRI)

9、和心臟指數(shù)，肝腎功、心臟生化及凝血功能的差異無顯著意義。(2)治療后各組之間的乳酸水平的差異有顯著性意義，其中ULI、CVVH和CVVH-ULI組的乳酸水平顯著低于control組，但這三組之間兩兩比較的差異無顯著性意義。(3)治療后各組之間多巴胺用量之間的差異無顯著性意義，但去甲腎上腺素用量的差異有顯著性意義，其中ULI、CVVH和CVVH-ULI組的去甲腎上腺素用量顯著低于control組，但這三治療組組之間差異的兩兩比較無顯著性意

10、義。(4)治療后各組之間CVP、SVRI的差異無顯著性意義，但CVP、ITBI、ELWI及CI的差異有顯著性意義。組間兩兩比較發(fā)現(xiàn)，三個(gè)治療組的ITBI、ELWI顯著低于對照組，而CI則顯著高于對照組。另外，CVVH-ULI組的ITBI顯著低于ULI組，在各治療組之間的ELWI兩兩比較中，CVVH、CVVH-ULI組的ELWI要顯著低于ULI組，CVVH-ULI組又顯著低于CVVH組。在CI的比較中，各治療組之間差異無顯著性意義。(5)

11、治療后各組患者之間的ALT、AST差異無顯著性意義，而TBIL及DBIL的差異有顯著性意義。其中ULI、CVVH和CVVH-ULI組的TBIL及DBIL顯著低于常規(guī)治療組，另外CVVH-ULI組的DBIL還顯著低于ULI組。(6)治療后各組患者之間的Cr、BUN及CysC差異有顯著性意義。其中ULI、CVVH和CVVH-ULI組的Cr、BUN及CysC顯著低于control組，另外CVVH和CVVH-ULI組的Cr和BUN顯著低于ULI

12、組。(7)治療后各組患者之間的CK-MB差異而顯著性意義，而Tn差異有顯著性意義，其中個(gè)治療組Tn顯著低于control組。(8)治療后各組患者之間的OI差異有顯著性意義。其中各治療組的OI顯著低于control組，而CVVH和CVVH-ULI組的OI顯著低于ULI組。(9)治療后各組患者之間的IL-6、TNF-α均數(shù)較control組有下降，但各組之間IL-6差異無顯著性意義，而TNF-α差異又顯著性意義。其中ULI、CVVH和CVV

13、H-ULI組的TNF-α顯著低于control組。(10)治療后各組患者之間的vWF、E-選擇素差異有顯著性意義。其中ULI、CVVH和CVVH-ULI組的vWF、E-選擇素顯著低于control組。(11)本研究中觀察了各治療組患者的ICU病死率、28天病死率及院內(nèi)病死率的差異。研究發(fā)現(xiàn)，對照組ICU病死率、28天病死率及院內(nèi)病死率分別為38％，44％及44％。但各組之間ICU病死率、28天病死率及院內(nèi)病死率的差異無顯著性意義。

14、>　　細(xì)胞學(xué)研究:(1)常規(guī)治療組血清處理的內(nèi)皮細(xì)胞對白蛋白的滲漏顯著增加。而ULI、CVVH或者CVVH聯(lián)合ULI治療則顯著減少白蛋白滲漏。另外，CVVH-ULI組血清內(nèi)皮細(xì)胞對白蛋白的滲漏較單一ULI處理組要顯著減輕。上述結(jié)果表明，ULI、CVVH或CVVH聯(lián)合ULI能顯著降低膿毒癥患者內(nèi)皮細(xì)胞的通透性;另外，CVVH聯(lián)合ULI治療的效果要由于單一ULI治療。(2)常規(guī)治療組患者血清刺激的內(nèi)皮細(xì)胞骨架發(fā)生紊亂和重排，而烏司他丁、血液

15、濾過或者二者聯(lián)合治療的患者血清所引起的內(nèi)皮細(xì)胞骨架改變則顯著弱于對照組。這提示，烏司他丁和血液濾過等治療能夠減輕內(nèi)皮細(xì)胞骨架的重排。(3)常規(guī)治療組血清刺激的內(nèi)皮細(xì)胞p38磷酸化水平顯著增加，而采用ULI及CVVH治療后的血清刺激內(nèi)皮細(xì)胞中p38的磷酸化水平顯著低于未治療組和常規(guī)治療組。而ERK和JNK的磷酸化水平在各組之間沒有顯著性差異。(4)膿毒癥患者血清刺激使內(nèi)皮細(xì)胞通透性顯著增高，而p38抑制劑SB203580顯著抑制增高的通透

16、性，但ERK及JNK抑制劑則不能抑制膿毒癥血清誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞的高通透性。(5)當(dāng)觀察p38抑制對內(nèi)皮細(xì)胞骨架重排的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，p38抑制劑可顯著抑制膿毒癥患者血清所誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞骨架的重排。(6)常規(guī)治療組(control)血清刺激的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡較FBS對照組顯著增加，而用ULI、CVVH或CVVH-ULI組血清處理的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡較常規(guī)治療組顯著減少;另外，CVVH-ULI組內(nèi)皮細(xì)胞凋亡數(shù)顯著少于ULI組。表明，ULI、CVVH以及CV