1、目的:本研究使用Cerebus多通道神經(jīng)信號(hào)記錄系統(tǒng)同步記錄6-OHDA誘導(dǎo)的PD模型大鼠PPN、初級(jí)運(yùn)動(dòng)皮層(primary motor cortex，M1)和STN三個(gè)部位的局部場(chǎng)電位，并對(duì)這些部位的電活動(dòng)進(jìn)行功率譜密度、相干性以及格蘭杰因果分析，從而實(shí)現(xiàn)以下三個(gè)研究目的:(1)記錄研究PD模型大鼠PPN中的振蕩性電活動(dòng);(2)研究PPN的振蕩性電活動(dòng)和皮層-基底節(jié)環(huán)路的振蕩性電活動(dòng)之間的關(guān)系;(3)研究左旋多巴藥物對(duì)PPN和皮層-

2、基底節(jié)環(huán)路的振蕩性電活動(dòng)的影響。
　　方法:1、實(shí)驗(yàn)分組
　　本實(shí)驗(yàn)選用健康成年的無特定病原體（Specified pathogen free，SPF）級(jí)雄性SD大鼠(Sprague Dawley rat)30只。隨機(jī)分為三組:(1)假損毀組(n=10)，右側(cè)前腦內(nèi)側(cè)縱束(medial forebrain bundle，MFB)立體定向注射4μl生理鹽水;(2)損毀組(n=13)，右側(cè)MFB立體定向注射4μl6-OHDA溶液

3、（3μ上g/μl），損毀黑質(zhì)致密部（substantia nigra pars compacta, SNc）多巴胺能神經(jīng)元;(3)損毀+左旋多巴組(n=7)，右側(cè)MFB立體定向注射4μl6-OHDA溶液（3μg/μl），并且接受左旋多巴藥物治療。
　　2、實(shí)驗(yàn)流程
　　(1)所有大鼠在多通道電極植入手術(shù)前適應(yīng)性飼養(yǎng)一周，并進(jìn)行轉(zhuǎn)棒行為學(xué)訓(xùn)練，轉(zhuǎn)棒轉(zhuǎn)速6圈/分鐘，每天訓(xùn)練3次，每次讓大鼠靜止站立于轉(zhuǎn)棒上5分鐘，接著在轉(zhuǎn)棒上行走

4、5分鐘;(2)對(duì)所有大鼠進(jìn)行多通道記錄電極植入手術(shù)，同時(shí)損毀組和損毀+左旋多巴組在腦內(nèi)注射6-OHDA制作PD大鼠模型，假損毀組注射等量生理鹽水;(3)術(shù)后休息恢復(fù)一周后，再次進(jìn)行轉(zhuǎn)棒行為學(xué)訓(xùn)練，操作同前;(4)術(shù)后兩周進(jìn)行阿撲嗎啡旋轉(zhuǎn)測(cè)試，初步評(píng)估造模效果;(5)術(shù)后三周開始進(jìn)行電生理記錄采集數(shù)據(jù);(6)數(shù)據(jù)收集完畢后，處死大鼠進(jìn)行組織學(xué)檢測(cè)。
　　3、模型的制作和記錄電極的植入
　　所有大鼠戊巴比妥鈉腹腔麻醉，固定于立體

5、定向儀。青霉素腹腔注射預(yù)防感染。根據(jù)Paxinos and Watson的《大鼠腦立體定向圖譜》，以前囟為參考點(diǎn)，計(jì)算右側(cè)MFB以及右側(cè)M1、STN、PPN的坐標(biāo)，在顱骨上標(biāo)記（MFB:前囟后1.8mm，中線旁開2.0mm，深度顱骨下8.3mm; M1:前囟前1.0mm，中線旁開2.3mm，顱骨下2.0mm; STN:前囟后3.5mm，中線旁開2.5mm，顱骨下8.2mm;PPN:前囟后7.8mm，中線旁開2.0mm，顱骨下7.2mm)

6、。高速渦輪牙鉆在各標(biāo)記點(diǎn)鉆孔至硬腦膜，MFB處骨窗0.5mm，M1、STN、PPN處骨窗1.0mm，安裝6個(gè)錨定螺釘，貼至硬腦膜，固定和連接電極地線。用10μl微量注射器在損毀組和損毀+左旋多巴組大鼠右側(cè)MFB注入新鮮配制的含0.02％維生素C的6-OHDA溶液(12μg/4μl)，假損毀組右側(cè)MFB注入4μl含0.02％維生素C的生理鹽水。顯微鏡下去除M1、STN、PPN骨窗內(nèi)的硬腦膜，依次在三個(gè)部位植入8導(dǎo)不銹鋼微絲電極。吸干顱骨表

7、面液體，牙托水泥固定電極絲，覆蓋全部顱骨并制作成電極連接的平臺(tái)。
　　4、神經(jīng)電信號(hào)數(shù)據(jù)采集
　　所有大鼠在手術(shù)后三周開始進(jìn)行M1、STN、PPN的局部場(chǎng)電位數(shù)據(jù)的采集，分別記錄大鼠在轉(zhuǎn)棒儀上靜止和行走兩種行為狀態(tài)下的電活動(dòng)。微電極陣列的接口與headstages連接，使大鼠平穩(wěn)站立在轉(zhuǎn)棒上，適應(yīng)片刻后保持靜止，記錄5分鐘靜止?fàn)顟B(tài)下的局部場(chǎng)電位，接著調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)棒儀轉(zhuǎn)速至6圈/分鐘，再記錄5分鐘行走狀態(tài)下的局部場(chǎng)電位。每只大鼠一共

8、記錄6次5分鐘靜止和5分鐘行走狀態(tài)下的局部場(chǎng)電位。記錄電活動(dòng)的同時(shí)使用攝像頭錄像監(jiān)測(cè)和記錄大鼠的行為，以備后續(xù)分析。采集局部場(chǎng)電位時(shí)，以地線作參考，采樣率10 KHz，放大倍數(shù)300×，帶通濾波0.3-500 Hz。所有大鼠記錄6次完畢后，損毀+左旋多巴組大鼠給予腹腔注射左旋多巴（5 mg/Kg）和芐絲肼（15mg/Kg），給藥20分鐘后開始記錄局部場(chǎng)電位，操作同上，每只大鼠記錄6次給藥后5分鐘靜止和5分鐘行走狀態(tài)下的局部場(chǎng)電位。

9、>　　5、組織學(xué)
　　所有大鼠記錄完畢后腹腔麻醉，電極連接電毀損儀通以陽極直流電，使電極尖端涌出鐵離子，與亞鐵氰化鉀生成藍(lán)色絡(luò)合物定位電極尖端。開胸心臟灌注生理鹽水，直至肝臟顏色變白，換成含5％亞鐵氰化鉀的4％多聚甲醛溶液，量約400ml/只。斷頭取腦多聚甲醛外固定24小時(shí)，25％和30％蔗糖脫水，包埋劑包埋-80℃冰箱快速冷凍。切片時(shí)，先冠狀位修整腦組織平面，參照Paxinosand Watson的《大鼠腦立體定向圖譜》確定M1

10、、STN、SNc、PPN的位置，在接近各確定部位時(shí)作連續(xù)冠狀切片，每隔3張切片保留2張，M1、STN、PPN三個(gè)部位片厚40μm，SNc處片厚25μm。SNc處的切片進(jìn)行TH免疫組化染色確定多巴胺能神經(jīng)元損毀情況，M1、STN、PPN的切片進(jìn)行尼氏染色確定電極尖端的位置。
　　6、局部場(chǎng)電位數(shù)據(jù)分析
　　本實(shí)驗(yàn)對(duì)局部場(chǎng)電位的分析包括三個(gè)方面:功率譜密度（Power spectraldensity）、相干性(Coherence

11、)、格蘭杰因果分析（Granger causality analysis）。分析之前需要對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行初步篩選，根據(jù)組織切片染色結(jié)果，剔除電極尖端不在目標(biāo)腦區(qū)或核團(tuán)所屬范圍的大鼠。每只大鼠每個(gè)腦區(qū)或核團(tuán)選取1-2根微電極絲所采集的噪音較少的數(shù)據(jù)，每種行為狀態(tài)（靜止或行走）選取120秒無明顯噪音、偽跡的時(shí)間段進(jìn)行計(jì)算。
　　7、統(tǒng)計(jì)學(xué)
　　采用SPSS20.0、MATLAB和GraphadPad prism5.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析和

12、作圖。假損毀組和損毀組大鼠功率譜密度的差異以及相干性的差異需要在0-100Hz上逐個(gè)頻率點(diǎn)進(jìn)行比較，為解決多重比較問題，本實(shí)驗(yàn)采用cluster-based，nonparametric permutation t-tests(n=1,000 permutations, corrected for multiplecomparisons)的方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)，每個(gè)頻率點(diǎn)的數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。β頻段的功率譜、相干性和格蘭杰因果系數(shù)在假損

13、毀組、損毀組和損毀+左旋多巴組之間的比較均采用Kruskal-Wallis test及Dunn's Multiple Comparison Test posthoc的統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)方法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:1、損毀黑質(zhì)紋狀體多巴胺神經(jīng)元后功率譜密度的變化
　　在大鼠行走運(yùn)動(dòng)時(shí)，損毀組大鼠三個(gè)部位的β頻段功率均較假損毀組顯著增高，但各自增高的頻段范圍不完全一致，M1為15-24 Hz(P=0.042)，ST

14、N為13-28Hz(P=0.014)，PPN為14-22 Hz(P=0.035)。在大鼠靜止時(shí)，損毀組大鼠M1的β頻段功率較假損毀組顯著增高，頻率范圍為21-35 Hz(P=0.042)，而靜止時(shí)兩組大鼠STN、PPN的功率譜密度在0-100Hz上均未見顯著差異(P＞0.05)。
　　2、損毀黑質(zhì)紋狀體多巴胺神經(jīng)元后對(duì)相干性的影響
　　在大鼠行走運(yùn)動(dòng)時(shí)，損毀組大鼠三個(gè)部位兩兩之間β頻段的相干性均較假損毀組顯著增高，M1-ST

15、N為10-34 Hz(P=0.004)， M1-PPN為11-36 Hz(P=0.006)， STN-PPN為14-28 Hz(P=0.01)。在大鼠靜止時(shí)，兩組大鼠三個(gè)部位各自之間的相干性在0-100Hz上均未見顯著差異(P＞0.05)。
　　3、多巴胺能藥物治療對(duì)β頻段功率譜密度和相干性的影響
　　帕金森病模型大鼠在接受左旋多巴治療后，原本在β頻段增加的功率譜密度和相干性均降低到正常水平（P＜0.05）。
　　4、

16、β振蕩電活動(dòng)格蘭杰因果分析結(jié)果
　　格蘭杰因果分析結(jié)果顯示，在STN→M1(P＜0.001)、STN→PPN(P＜0.001)和PPN→M1(P＜0.001)三個(gè)方向上，6-OHDA損毀組的β頻段格蘭杰因果系數(shù)顯著高于假損毀組和損毀+左旋多巴組;而在各自的反方向上(M1→STN、PPN→STN、M1→PPN)，三組的β頻段格蘭杰因果系數(shù)沒有顯著差異(P＞0.05)。這說明β振蕩電活動(dòng)在M1、STN、PPN三個(gè)部位之間的流動(dòng)方向是S

17、TN→M1、STN→PPN和PPN→M1;并且多巴胺能藥物（左旋多巴）治療后，STN→M1、STN→PPN和PPN→M1三個(gè)方向上的β頻段格蘭杰因果系數(shù)降低到正常水平。
　　結(jié)論:1、本實(shí)驗(yàn)在帕金森病模型大鼠行走時(shí)記錄到了在M1、STN和PPN三個(gè)部位增強(qiáng)的β頻段振蕩電活動(dòng)，是首次在6-OHDA帕金森病模型大鼠PPN記錄到增強(qiáng)的β振蕩電活動(dòng)的研究。且PPN中記錄到的β振蕩電活動(dòng)很有可能來自于基底節(jié)中的STN。
　　2、根據(jù)格