1、背景：癌癥是嚴(yán)重危害公眾健康的疾病之一，其發(fā)病率和死亡率一直在攀升，已成為疾病死因之首。一些高表達(dá)的細(xì)胞表面分子參與了癌癥的發(fā)生，發(fā)展，并預(yù)示著不良臨床結(jié)局。在這些細(xì)胞分子中，分化抗原簇44（Cluster of Differentiation44，CD44）是一種由外顯子選擇性剪切而形成的蛋白家族。CD44跨膜糖蛋白家族介導(dǎo)了各種細(xì)胞生物學(xué)過程，包括生長，生存，分化及運(yùn)動的調(diào)控。CD44是透明質(zhì)酸的天然受體，也可以與其他配體結(jié)合，如骨

2、橋蛋白，膠原和基質(zhì)金屬蛋白酶等等。CD44與HER2，Src激酶和ERK等配體的結(jié)合，可以直接激發(fā)不同信號通路之間的交叉反應(yīng)。卵巢癌的死亡率在女性惡性腫瘤中位居第五，而且是致死率最高的女性生殖腫瘤。但是在過去的幾十年里，傳統(tǒng)的卵巢癌治療方案，即手術(shù)切除病灶聯(lián)合化療藥物并沒有明顯改善卵巢癌患者的總體生存期。目前，我們對卵巢癌發(fā)生進(jìn)展的具體機(jī)制還了解甚少。CD44的表達(dá)上調(diào)加強(qiáng)了腫瘤干細(xì)胞的分化，腫瘤細(xì)胞的增殖，耐藥產(chǎn)生和轉(zhuǎn)移。但是，CD4

3、4的表達(dá)在卵巢癌中的臨床意義仍然存有爭議。目前，還鮮有CD44的表達(dá)水平與卵巢癌患者的長期隨訪相關(guān)的研究。也尚未發(fā)現(xiàn)已報道的CD44與卵巢癌的相關(guān)研究中，將患者原發(fā)病灶，轉(zhuǎn)移病灶及復(fù)發(fā)病灶聯(lián)合分析。：骨肉瘤是一種主要累及骨骼的肉瘤。盡管近年來手術(shù)治療聯(lián)合多種藥物化療方案治療骨肉瘤取得了一定進(jìn)展，但迄今為止，介導(dǎo)骨肉瘤惡性進(jìn)展事件的細(xì)胞分子機(jī)制尚不清楚，包括轉(zhuǎn)移病灶的形成，耐藥現(xiàn)象的產(chǎn)生等等。已發(fā)表的CD44與骨肉瘤相關(guān)研究結(jié)果顯示CD4

4、4敲除小鼠骨肉瘤動物模型中骨肉瘤轉(zhuǎn)移受到抑制。但是，基于大量的骨肉瘤臨床組織標(biāo)本和完善的臨床信息，關(guān)于CD44臨床關(guān)聯(lián)性的研究，還尚未見報道。微小RNA（microRNA，miR）可以結(jié)合靶基因mRNA的3'-非翻譯區(qū)，參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的眾多生物學(xué)功能。是否有特異性的microRNA通過調(diào)控CD44而參與骨肉瘤的發(fā)生進(jìn)展有待進(jìn)一步研究。探究惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展機(jī)制是我們在攻克腫瘤道路上非常重要的環(huán)節(jié)，而研發(fā)新型腫瘤治療策略也不容忽視。因此

5、，研發(fā)新型腫瘤多藥耐藥逆轉(zhuǎn)策略，已經(jīng)成為腫瘤治療過程中的關(guān)鍵。腫瘤多藥耐藥的發(fā)生涉及復(fù)雜的分子機(jī)制，其中最為經(jīng)典的機(jī)制是P-糖蛋白（P-glycoprotein，Pgp）的高表達(dá)，Pgp屬于ATP依賴的跨膜蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)體家族的成員，是多藥耐藥基因1（Multidrug resistance1，MDR1）的蛋白產(chǎn)物。Pgp可將一些化療藥物通過主動轉(zhuǎn)運(yùn)作用外排細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)有效的藥物濃度不足，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對化療藥物產(chǎn)生抵抗。因此，Pgp是逆轉(zhuǎn)腫瘤

6、多藥耐藥最有潛力的靶點(diǎn)之一。隨著1998年基因沉默的發(fā)現(xiàn)，小干擾RNA（small interference RNA，siRNA）為提高耐藥腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性提供了新途徑?；騻鬟f過程中，有效的追蹤和定位，對于我們了解被攜帶基因在胞漿內(nèi)的命運(yùn)非常重要。納米技術(shù)的快速發(fā)展為基因傳遞和追蹤提供了廣闊的平臺。目前，大多數(shù)納米給藥系統(tǒng)的追蹤定位采用紫外線或短波長可見光作為激發(fā)光源，但是由于激發(fā)光的光毒性和較差的組織穿透性，限制了這些納米

7、系統(tǒng)的臨床應(yīng)用。然而，上轉(zhuǎn)換納米材料（Upconversion nanoparticle，UCNP）可使用近紅外光作為激發(fā)光源，并將其轉(zhuǎn)換為肉眼可見的發(fā)射光。因此，上轉(zhuǎn)換納米應(yīng)用于基因傳遞和追蹤將具有眾多優(yōu)勢，包括無光損傷，無自熒光，無熒光淬滅和較深的組織穿透深度。盡管一些研究已經(jīng)表明上轉(zhuǎn)換納米可以用于基因的傳遞和追蹤，但是，尚未發(fā)現(xiàn)應(yīng)用上轉(zhuǎn)換納米治療腫瘤耐藥同時追蹤定位攜帶基因的相關(guān)研究報道。
　　目的：評估CD44表達(dá)在卵巢癌

8、中的臨床意義，然后進(jìn)一步研究CD44在卵巢癌進(jìn)展中的生物學(xué)功能。
　　方法：①免疫組織化學(xué)染色法檢測人類卵巢癌組織芯片中CD44的表達(dá)水平。納入本研究的研究對象是在美國哈佛醫(yī)學(xué)院麻省總醫(yī)院接受治療的26例卵巢癌患者，其中每例患者均有原發(fā)期，轉(zhuǎn)移期和復(fù)發(fā)期的腫瘤組織標(biāo)本。②建立人卵巢癌細(xì)胞的裸小鼠移植瘤模型，蛋白印跡法（Western blot）檢測腫瘤復(fù)發(fā)的過程中，腫瘤組織CD44蛋白表達(dá)水平的變化。③Western blot和細(xì)

9、胞免疫熒光法檢測細(xì)胞的CD44蛋白表達(dá)水平。④MTT法和3D細(xì)胞培養(yǎng)法分別檢測細(xì)胞的增殖能力和細(xì)胞球體形成能力。⑤MTT法檢測細(xì)胞對化療藥物紫杉醇的敏感性。⑥采用劃痕修復(fù)實驗和基質(zhì)膠侵襲實驗，分別檢測細(xì)胞的遷移和侵襲潛能。⑦采用GraphPad Prism5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析，所有數(shù)據(jù)表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差。兩組數(shù)據(jù)間的比較方法為雙側(cè)Student’s t-test或Mann-Whitney’s檢驗。無病生存期分析和總生存期分析方法為

10、Kaplan-Meier survival curves和Gehan-Breslow-Wilcoxon test。以α=0.05作為檢驗水準(zhǔn)。
　　結(jié)果：⑴免疫組織化學(xué)染色人類卵巢癌組織芯片的結(jié)果表明，原發(fā)，轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)卵巢癌組織CD44表達(dá)相對評分分別為1.43，2.06和2.04。其中轉(zhuǎn)移組與原發(fā)組比較P<0.05，復(fù)發(fā)組與原發(fā)組比較P<0.05。⑵生存分析結(jié)果顯示，高蛋白表達(dá)水平的CD44與卵巢癌患者總生存率關(guān)聯(lián)性P<0.05

11、，CD44與無病生存率關(guān)聯(lián)性P<0.05。⑶SKOV-3／SKOV-3TR和OVCAR8／OVCAR8TR均表達(dá)一定蛋白水平的CD44，然而，耐藥細(xì)胞 SKOV-3TR和OVCAR8TR均比其對應(yīng)的敏感細(xì)胞SKOV-3和OVCAR8表達(dá)較高蛋白水平的CD44（P<0.05）。⑷生理鹽水組與10 mg/kg紫杉醇組腫瘤組織中CD44蛋白表達(dá)水平比較沒有統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）。然而，20 mg/kg和25 mg/kg紫杉醇治療組腫瘤組織

12、中CD44表達(dá)水平與生理鹽水組比較均有顯著升高（P<0.05）。⑸成功建立OVCAR8Lentivirus only（空慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)）），OVCAR8Non-specific shRNA（攜帶非特異性shRNA慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)）和OVCAR8CD44 shRNA（攜帶CD44 shRNA慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)）三種細(xì)胞系，OVCAR8CD44 shRNA細(xì)胞中CD44蛋白表達(dá)被穩(wěn)定抑制。⑹與空白對照組OVCAR8比較，OVCAR8Lentivi

13、rus only和OVCAR8Non-specific shRNA的增殖狀況均無明顯差異（P>0.05），而OVCAR8CD44 shRNA細(xì)胞的生長被顯著抑制（P<0.05）。⑺OVCAR8CD44 shRNA細(xì)胞形成的細(xì)胞球體直徑比其他三種組細(xì)胞OVCAR8，OVCAR8Lentivirus only和OVCAR8Non-specific shRNA要?。≒<0.05）。⑻OVCAR8CD44 shRNA細(xì)胞幾乎不能夠耐受0.006

14、μM的紫杉醇，而在同樣給藥濃度下，OVCAR8，OVCAR8Lentivirus only和OVCAR8Non-specific shRNA細(xì)胞仍能夠較好地生長。⑼經(jīng)過24 h遷移后，空白對照組和非特異性siRNA轉(zhuǎn)染組中的細(xì)胞劃痕幾乎被修復(fù)。而CD44 esiRNA轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞劃痕修復(fù)能力明顯受到抑制（P<0.05）。⑽CD44 esiRNA轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞穿過基質(zhì)膠的數(shù)目明顯少于空白對照組和非特異性siRNA轉(zhuǎn)染組（P<0.05）。