1、背景和目的:
　　高血壓是全球重大可控性慢性疾病，已成為腦卒中、冠心病和心腎功能衰竭等的主要原因，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢。在高血壓的發(fā)病機制中，環(huán)境因素所起的作用約占60％。流行病學(xué)研究證實50％的高血壓為鹽敏感性高血壓，而寒冷也是導(dǎo)致高血壓的重要環(huán)境因素。很多食物中的天然成分，如咖啡因和薄荷醇具有調(diào)控血壓的作用。因此，探索膳食因子調(diào)控血壓的作用及分子機制對高血壓及心血管疾病的防治有重要的意義。
　　咖啡因是常用的精神活性物

2、質(zhì)，具有利尿和利鈉的作用。然而，由于咖啡因有激活交感神經(jīng)的作用，急性攝入咖啡因可升高血壓。近期研究發(fā)現(xiàn)，慢性攝入咖啡因可以改善代謝綜合征，并有降低血壓的作用，但其機制還不清楚。鈉鹽攝入過多是導(dǎo)致原發(fā)性高血壓發(fā)生、發(fā)展的重要環(huán)境因素，腎集合管上皮鈉通道(Epithelial sodiumchannel，ENaC)在鈉的重吸收和血壓調(diào)節(jié)中起著關(guān)鍵作用。研究報道咖啡因能夠影響細(xì)胞中一些調(diào)控ENaC的激酶的活性，但咖啡因是否作用于這些激酶從而調(diào)

3、節(jié)ENaC的表達(dá)和鈉的重吸收功能尚不清楚，咖啡因?qū)δI臟鈉重吸收和血壓的長期效應(yīng)亦鮮有報道。
　　薄荷醇為薄荷和薄荷精油中的主要成分，近年研究發(fā)現(xiàn)薄荷醇可激活感受寒冷的瞬時受體電位通道M8亞型(Transient receptor potential melastatin8，TRPM8)。TRPM8屬于非選擇性陽離子通道，能介導(dǎo)Ca2+、Na+、K+等陽離子內(nèi)流。研究證實，TRPM8除在神經(jīng)末梢表達(dá)，在血管平滑肌也有表達(dá)。薄荷醇激活

4、TRPM8使平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣信號增加，但尚不清楚薄荷醇調(diào)控血管收縮和舒張的分子機制。研究發(fā)現(xiàn)TRPM8對平滑肌細(xì)胞Ca2+內(nèi)流和肌漿網(wǎng)Ca2+釋放均有調(diào)節(jié)作用。因此，我們推測薄荷醇可能通過激活血管平滑肌TRPM8影響細(xì)胞內(nèi)Ca2+變化及相關(guān)信號通路，抑制血管收縮，降低血壓。
　　為了驗證上述推測，本研究分為兩部分進(jìn)行。第一部分為咖啡因?qū)ρ獕旱恼{(diào)控，觀察長期攝入咖啡因?qū)Ω啕}飲食的Dahl's鹽敏感大鼠血壓的影響，從細(xì)胞和分子水平闡明慢

5、性咖啡因干預(yù)調(diào)節(jié)血壓的機制，并觀察攝入咖啡因?qū)】等搜獕汉湍螂娊赓|(zhì)的影響。第二部分為薄荷醇對血壓的調(diào)控，探討薄荷醇激活TRPM8對血管收縮、舒張功能的調(diào)節(jié)，及其具體的分子機制。
　　材料方法:
　　整個研究包括離體實驗和在體實驗?？Х纫?qū)ρ獕旱恼{(diào)控使用Dahl's鹽敏感性高血壓大鼠和腎集合管細(xì)胞M1CCD作為研究對象。薄荷醇對血壓的調(diào)控使用TRPM8-/-小鼠和同窩野生對照小鼠的腸系膜動脈和培養(yǎng)的血管平滑肌細(xì)胞VSMCs作為

6、研究對象。
　　1.持續(xù)監(jiān)控高鹽飼料（對照組）和高鹽飼料+含0.1％咖啡因的水（咖啡因組）Dahl's鹽敏感性高血壓大鼠的血壓和活動度，每日測量飲水、進(jìn)食、體重。干預(yù)第15天結(jié)束時收集大鼠大便和24小時尿液檢測電解質(zhì)成分。大鼠腹腔注射ENaC特異性抑制劑阿米洛利后再次收集尿液測量尿電解質(zhì)成分，計算對照組和咖啡因組經(jīng)ENaC重吸收鈉的含量。
　　2.小動物超聲測量大鼠心臟結(jié)構(gòu)和功能。大鼠處死后測量腸系膜動脈內(nèi)皮依賴和內(nèi)皮非依賴

7、的舒張功能和電場刺激（Electrical field stimulation，EFS）介導(dǎo)的血管收縮功能，Ussing Chamber觀察咖啡因?qū)π∧c上皮電解質(zhì)轉(zhuǎn)運的影響。
　　3.Western blot檢測大鼠腎臟皮質(zhì)集合管ENaC的表達(dá)和調(diào)控ENaC相關(guān)激酶的表達(dá)情況及在調(diào)控ENaC中的作用，并在體外觀察咖啡因?qū)NaC通道活性的影響。
　　4.測量健康志愿者飲用咖啡對24小時尿電解質(zhì)和動態(tài)血壓的影響。
　　5

8、.Western blot檢測薄荷醇激活TRPM8-/-對血管平滑肌細(xì)胞RhoA/ROCK信號通路的影響。觀察薄荷醇對離體血管瞬時收縮成分和強直收縮成分的影響，并觀察去除血管內(nèi)皮對薄荷醇舒張血管作用的影響。
　　結(jié)果:
　　1.咖啡因干預(yù)組大鼠的收縮壓和平均動脈壓顯著低于對照組大鼠，慢性咖啡因干預(yù)對大鼠活動度、心率、心臟結(jié)構(gòu)、血漿兒茶酚胺及血管收縮和舒張功能均無影響。
　　2.咖啡因干預(yù)顯著增加Dahl's鹽敏感大鼠2

9、4h尿鈉濃度及24h鈉排出總量。
　　3.使用ENaC特異性抑制劑阿米洛利后，咖啡因組增加的鈉排出量顯著低于對照組。而使用腎小管鈉/氯共轉(zhuǎn)運體(NCC)抑制劑氫氯噻嗪后，兩組增加的鈉排出量無顯著性差異。
　　4.咖啡因干預(yù)能顯著降低皮質(zhì)集合管αENaC表達(dá)，而βENaC、γENaC和NCC表達(dá)無顯著性變化。
　　5.咖啡因干預(yù)降低腸道鈉氫共轉(zhuǎn)運體(NHE)介導(dǎo)的鈉水吸收，輕微增加糞便鈉排出。
　　6.咖啡因能顯著

10、增加小鼠腸粘膜上皮的短路電流(Isc)，抑制cAMP的產(chǎn)生可抑制咖啡因介導(dǎo)的Isc升高。阻斷肌漿網(wǎng)ryanodine受體和鈣激活的鉀通道可降低咖啡因介導(dǎo)的Isc升高。
　　7.咖啡因干預(yù)皮質(zhì)集合管細(xì)胞(M1CCD)可上調(diào)AMPKα表達(dá)及其磷酸化水平，抑制αENaC表達(dá)，并降低其開放概率。
　　8.健康志愿者喝普通咖啡15天后24小時尿量和尿鈉排出量顯著高于基線水平，收縮壓和舒張壓較對照組輕微降低。
　　9.薄荷醇激活T

11、RPM8可抑制U46619介導(dǎo)的小鼠腸系膜動脈的血管收縮。
　　10.薄荷醇對血管瞬時收縮和強直收縮成分均有抑制作用，但對強直收縮成分的抑制作用更強。薄荷醇對強直收縮成分的抑制作用與肌漿網(wǎng)鈣泵抑制劑和ROCK-2抑制劑Y27632類似。
　　11.當(dāng)血管處于舒張狀態(tài)時，薄荷醇濃度依賴的引起血管收縮，但血管收縮的幅度很小。薄荷醇的舒血管作用是內(nèi)皮非依賴性的。
　　結(jié)論:
　　1.慢性攝入咖啡因能減輕高鹽引起的鹽敏感