1、目的：
　　1．賴氨酰氧化酶（lysyl oxidase，LOX）的相互作用蛋白的驗證，明確蛋白相互作用位點。
　　2．探討LOX和XRCC5蛋白相互作用對乳腺癌細胞遷移與侵襲能力的影響。
　　方法：
　　1．在乳腺癌MDA-MB-231細胞轉(zhuǎn)染重組蛋白LOX-SF的慢病毒，通過western blot和RT-PCR對細胞中重組蛋白LOX-SF進行檢測。
　　2．采用雙向免疫共沉淀，免疫熒光共定位的實驗方法

2、驗證LOX與XRCC5和Histone H1.1的相互作用。
　　3.我們采用慢病毒作為載體的過表達技術(shù),分別構(gòu)建穩(wěn)定過表達LOX、過表達XRCC5的載體,單獨轉(zhuǎn)染和聯(lián)合轉(zhuǎn)染至低轉(zhuǎn)移潛能并且LOX低表達的MCF-7細胞中，分為未轉(zhuǎn)染組、LOX空載體組、LOX轉(zhuǎn)染組、XRCC5空載體組，XRCC5轉(zhuǎn)染組、LOX和XRCC5空載體共轉(zhuǎn)染組及LOX和XRCC5過表達共轉(zhuǎn)染組；流式分選聯(lián)合轉(zhuǎn)染LOX和XRCC5過表達載體及空載體共轉(zhuǎn)染的細

3、胞株，western blot和RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染后各組細胞的LOX和XRCC5蛋白表達的變化，分別通過Transwell遷移和侵襲實驗檢測轉(zhuǎn)染細胞的遷移與侵襲能力。
　　結(jié)果：
　　1.在MOI=10的條件下，LOX慢病毒轉(zhuǎn)染 MDA-MB-231細胞，96 h后鏡下觀察綠色熒光間接評估慢病毒轉(zhuǎn)染效率，發(fā)現(xiàn)慢病毒轉(zhuǎn)染效率＞90％。Western blot結(jié)果顯示：實驗組能檢測到重組蛋白LOX-SF和LOX本體蛋白，而空白

4、對照組和陰性對照組未能檢測到重組蛋白LOX-SF的條帶，僅都能檢測到LOX本體蛋白。RT-PCR結(jié)果：實驗組、空載對照組及空白對照組重組基因LOX mRNA的2-ΔΔCt值分別為15.32±0.12、1.18±0.01、1.00±0.00，實驗組LOX-SF mRNA表達水平明顯高于空載對照組和空白對照組（P＜0.01），空載對照組和空白對照組LOX-SF mRNA表達水平無明顯差異（P>0.05）。
　　2．免疫共沉淀（Co-I

5、P）結(jié)果表明，Western blot能檢測到LOX抗體沉淀的免疫復(fù)合物中含有XRCC5、Histone H1.1蛋白,且免疫印跡中出現(xiàn)的條帶與MDA-MB-231細胞總蛋白的條帶位置一致。
　　3.反向免疫共沉淀結(jié)果表明： Western blot能分別檢測到XRCC5抗體、Histone H1.1抗體沉淀的免疫復(fù)合物中含有LOX蛋白,且免疫印跡中出現(xiàn)的條帶與MDA-MB-231細胞總蛋白中的LOX蛋白條帶位置一致。
　　

6、4.實驗采取內(nèi)源性共定位分析（即未經(jīng)任何處理的MDA-MB-231細胞、MCF-7細胞）進行。分別用不同種屬的抗體進行免疫熒光定位分析，用激光共聚焦顯微鏡掃描(630×)可見，LOX與Histone H1.1共定位分析： LOX紅光標記，主要定位在胞質(zhì)，少部分在胞核，呈彌散分布；Histone H1.1綠光標記，主要定位在胞質(zhì)，LOX與Histone H1.1在胞質(zhì)存在明顯共定位，呈現(xiàn)黃色。LOX與XRCC5共定位分析：LOX綠光標記，

7、主要定位在胞質(zhì)及細胞核，呈彌散分6．采用Western blot及Real-time PCR分別檢測轉(zhuǎn)染后各組LOX和XRCC5在基因和蛋白水平的變化。Western blot結(jié)果能檢測到LOX蛋白在MCF-7有表達且為低表達；實驗組能檢測到重組蛋白LOX-SF和LOX本體蛋白，而空白對照組和陰性對照組未能檢測到重組蛋白LOX-SF的條帶，僅都能檢測到LOX本體蛋白。與未轉(zhuǎn)染組及空載體組比較，XRCC5過表達組的XRCC5蛋白表達明顯升

8、高。與空白對照組及陰性對照組比較，LOX和XRCC5過表達共轉(zhuǎn)染的細胞LOX和XRCC5蛋白表達量均明顯升高。Real-time PCR結(jié)果顯示：LOX過表達組、LOX空載體組、LOX和XRCC5過表達共轉(zhuǎn)染組、LOX和XRCC5空載體共轉(zhuǎn)染組及未轉(zhuǎn)染組的LOX mRNA的2-ΔΔCt值分別為241.04±45.81、2.86±0.41、207.12±23.40、2.06±0.06、1.00±0.00，LO X過表達組、LOX和XRCC

9、5過表達共轉(zhuǎn)染組的LOX mRNA表達水平明顯高于空載體組和未轉(zhuǎn)染組（P＜0.01），空載體組和未轉(zhuǎn)染組的LOX mRNA表達水平無明顯差異（P>0.05）。XRCC5過表達組、XRCC5空載體組、LOX和XRCC5過表達共轉(zhuǎn)染組、LOX和XRCC5空載體共轉(zhuǎn)染組及未轉(zhuǎn)染組的XRCC5 mRNA的2-ΔΔCt值分布；XRCC5紅光標記，定位在細胞核內(nèi)，也呈彌散分布；LOX和XRCC5在細胞核存在明顯的共定位，呈現(xiàn)黃色。
　　5．在

10、MOI=10條件下，將LOX和XRCC5過表達慢病毒載體聯(lián)合轉(zhuǎn)染乳腺癌MCF-7細胞后，對LOX和XRCC5過表達共轉(zhuǎn)染組及LOX和XRCC5空載體共轉(zhuǎn)染組細胞進行流式熒光分選，通過流式熒光檢測LOX和XRCC5空載體共轉(zhuǎn)染組篩選出的細胞轉(zhuǎn)染效率由15.37%提高到83.94%，LOX和XRCC5過表達共轉(zhuǎn)染組的細胞流式熒光檢測，轉(zhuǎn)染效率由45.65%提高到70.82%。
　　6．采用Western blot及Real-time

11、PCR分別檢測轉(zhuǎn)染后各組LOX和XRCC5在基因和蛋白水平的變化。Western blot結(jié)果能檢測到LOX蛋白在MCF-7有表達且為低表達；實驗組能檢測到重組蛋白LOX-SF和LOX本體蛋白，而空白對照組和陰性對照組未能檢測到重組蛋白LOX-SF的條帶，僅都能檢測到LOX本體蛋白。與未轉(zhuǎn)染組及空載體組比較，XRCC5過表達組的XRCC5蛋白表達明顯升高。與空白對照組及陰性對照組比較，LOX和XRCC5過表達共轉(zhuǎn)染的細胞LOX和XRCC

12、5蛋白表達量均明顯升高。Real-time PCR結(jié)果顯示：LOX過表達組、LOX空載體組、LOX和XRCC5過表達共轉(zhuǎn)染組、LOX和XRCC5空載體共轉(zhuǎn)染組及未轉(zhuǎn)染組的LOX mRNA的2-ΔΔCt值分別為241.04±45.81、2.86±0.41、207.12±23.40、2.06±0.06、1.00±0.00，LO X過表達組、LOX和XRCC5過表達共轉(zhuǎn)染組的LOX mRNA表達水平明顯高于空載體組和未轉(zhuǎn)染組（P＜0.01），

13、空載體組和未轉(zhuǎn)染組的LOX mRNA表達水平無明顯差異（P>0.05）。XRCC5過表達組、XRCC5空載體組、LOX和XRCC5過表達共轉(zhuǎn)染組、LOX和XRCC5空載體共轉(zhuǎn)染組及未轉(zhuǎn)染組的XRCC5 mRNA的2-ΔΔCt值分別為6.57±0.85、1.10±0.27、4.29±0.05、0.76±0.15、1.00±0.00。XRCC5過表達組、LOX和XRCC5過表達共轉(zhuǎn)染組的XRCC5 mRNA表達水平明顯高于空載體組和未轉(zhuǎn)染組

14、（P＜0.05），空載體組和未轉(zhuǎn)染組的XRCC5 mRNA表達水平無明顯差異（P>0.05）。
　　7．Transwell遷移實驗觀察遷移細胞數(shù)目，相對于空載體組（71.67±3.51），LOX過表達組(358.67±18.58)、XRCC5過表達組(200.67±11.02)及LOX和XRCC5過表達共轉(zhuǎn)染組（513.33±15.28）的細胞遷移能力均明顯增強（P<0.05）。LOX和XRCC5過表達共轉(zhuǎn)染組穿過細胞數(shù)最多，與單

15、獨轉(zhuǎn)染組即LOX過表達組和XRCC5過表達組比較，差異顯著（P<0.05），細胞的遷移能力明顯增強。
　　8. Transwell侵襲實驗觀察侵襲細胞數(shù)目，LOX過表達組(97.00±7.55)、XRCC5過表達組(74.33±6.66)及LOX和XRCC5過表達共轉(zhuǎn)染組（140.00±24.98）的細胞侵襲能力均比空載體組（14.67±4.73）的明顯增強（P<0.05），且LOX和XRCC5過表達共轉(zhuǎn)染組細胞的侵襲能力明顯強于

16、LOX過表達組和XRCC5過表達組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.LOX與XRCC5存在直接或間接相互作用。
　　2. LOX與Histone H1.1存在直接或間接相互作用。
　　3.在MCF-7細胞中，上調(diào)LOX和XRCC5的表達可以增強細胞的遷移、侵襲能力，且兩者的聯(lián)合轉(zhuǎn)染能進一步促進MCF-7細胞的遷移和侵襲能力。LOX和XRCC5相互作用可能協(xié)同促進乳腺癌細胞的遷移和侵襲能力。