1、第一部分:EX-ACEA-0010MA對急性髓細胞白血病(AML)細胞株的作用。
　　目的:
　　探索EX-ACEA-0010MA對AML細胞株的生長抑制、周期阻滯、誘導凋亡以及抑制集落形成的作用，為下一步研究作用機制打下基礎。
　　方法:
　　應用MTT法檢測EX-ACEA-0010MA對AML細胞株和人正常的肝細胞株L02細胞的生長抑制作用，并與已有的布魯頓酪氨酸激酶抑制劑Ibrutinib進行比較;集落培養(yǎng)

2、法、AnnexinⅤ/PI雙染法和流式細胞術檢測EX-ACEA-0010MA作用AML細胞株細胞后細胞的集落形成能力、細胞凋亡和細胞周期情況;Hoechst33258染色法觀察EX-ACEA-0010MA誘導細胞凋亡的形態(tài)學變化。
　　結果:
　　(1)不同濃度的EX-ACEA-0010MA作用于AML細胞株U937、KG-1以及正常肝細胞L02后，前兩者24h的半數(shù)致死率(IC50)分別為1.05μM和6.48μ M;48

3、h的IC50值分別為0.34μM和4.78μM，而對L02細胞株無明顯殺傷作用。說明該藥物對正常細胞毒副作用較小。不同濃度的Ibrutinib作用于AML細胞株U937、KG-1和L02細胞后，前兩者24h的IC50分別為19.46μM和44.97μM;48h的IC50值分別為8.08μM和9.30μM。(2)將1.25μM的EX-ACEA-0010MA和20μM的Ibrutinib分別作用于L02細胞24h后發(fā)現(xiàn)EX-ACEA-001

4、0MA對正常肝臟細胞L02的毒性作用明顯比Ibrutinib低(p＜0.001)。(3)EX-ACEA-0010MA作用于U937和KG-1后，隨著藥物濃度的增加，抑制其集落形成的現(xiàn)象更加明顯。(4)EX-ACEA-0010MA對U937和KG-1均有誘導凋亡的作用。(5)EX-ACEA-0010MA對U937有明顯的周期阻滯，1.25μM藥物作用24h后能明顯阻滯G0/G1期。但在藥物對KG-1的IC50濃度時，其對KG-1周期阻滯作

5、用不明顯。(6)分別以1.25μM和10μM的EX-ACEA-0010MA作用于U937和KG-1細胞株24h后，經(jīng)Hoechst33258染色法染色后，可發(fā)現(xiàn)與對照組相比細胞核內出現(xiàn)明顯的凋亡小體，進而從形態(tài)學上證明了EX-ACEA-0010MA可以誘導AML細胞發(fā)生凋亡。
　　結論:
　　(1) EX-ACEA-0010MA對AML細胞株的增殖抑制作用比Ibrutinib的作用強，并且對正常對照細胞L02無明顯殺傷作用，

6、比Ibrutinib更具有安全性。(2)EX-ACEA-0010MA具有顯著地抑制集落形成能力和促進細胞凋亡能力，并且對U937細胞株有明顯的周期阻滯能力。
　　第二部分:EX-ACEA-0010MA抗急性髓細胞白血病的作用機制
　　目的:
　　探索EX-ACEA-0010MA對AML細胞株的作用機制
　　方法:
　　應用Western Blot法檢測EX-ACEA-0010MA作用U937、KG-1細胞株

7、細胞后檢測BTK、p-BTK、PI3K/AKT通路蛋白，Caspase家族蛋白和BCL2家族蛋白的表達變化以及G1/S期檢測點周期依賴性激酶CDK2、CDK4和CDK6;免疫熒光檢測EX-ACEA-0010MA作用U937、KG-1細胞株細胞后p-NF-κB(p-P65)的表達。
　　結果:
　　(1) Western Blot檢測顯示EX-ACEA-0010MA作用后U937和KG-1細胞中p-BTK蛋白的含量明顯降低而總

8、的BTK蛋白沒有明顯改變。(2)PI3K/AKT通路中關鍵蛋白PI3K(p110)和p-AKT以及下游的p-IKK均隨著藥物濃度的增高而降低。
　　(3) Caspase3、Caspase8和PARP均有明顯激活，而Caspase9沒有明顯激活且BCL2家族蛋白均沒有明顯變化。GO/G1期檢測點蛋白CDK2、CDK4和CDK6的表達均有下降。(4)用10μM的EX-ACEA-0010MA作用U937、KG-1細胞株細胞后經(jīng)免疫熒光

9、法鏡下觀察發(fā)現(xiàn)p-P65的表達及入核較對照組減少。
　　結論:
　　(1) EX-ACEA-0010MA通過抑制PI3K/AKT通路，從而抑制下游p-P65的表達，阻止其入核發(fā)揮轉錄因子作用而實現(xiàn)其促進細胞凋亡的作用。(2)EX-ACEA-0010MA可通過抑制周期蛋白依賴性激酶CKD2、CDK4和CDK6的表達，阻止白血病細胞進入S期，從而阻止白血病細胞DNA的復制。(3)EX-ACEA-0010MA誘導AML細胞株凋亡的